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Cloning and sequence analysis of E2 gene of bovine viral diarrhea virus HB-DCZ strain in Hebei province of China 被引量:1
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作者 ZHAO Yue-lan ZUO Yu-zhu +3 位作者 FAN Jing-hui ZHANG Lei QIN Jian-hua ZHANG Ning 《Journal of Agricultural Science and Technology》 2008年第10期6-11,16,共7页
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2基因 HB 序列分析 克隆 中国 河北省 PCR扩增
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BVDV中E^(rns)、N^(pro)蛋白真核表达质粒的构建
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作者 巩转娣 裴梦源 +3 位作者 拜小强 袁肇方 李殿玉 魏锁成 《西北民族大学学报(自然科学版)》 2024年第2期46-53,共8页
目的:试验旨在构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白(糖基化囊膜蛋白E^(rns))和非结构蛋白(N^(pro))重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对E^(rns)、N^(pro)进行表达.方法:参考GenBank中公布的BVDV参考株核苷酸序列分别设计引物N^(pro... 目的:试验旨在构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白(糖基化囊膜蛋白E^(rns))和非结构蛋白(N^(pro))重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对E^(rns)、N^(pro)进行表达.方法:参考GenBank中公布的BVDV参考株核苷酸序列分别设计引物N^(pro)-F/R和E^(rns)-F/R,用BVDV病毒的cDNA进行PCR扩增,将回收纯化的N^(pro)和E^(rns)目的基因和真核表达载体pCMV-Myc进行双酶切.利用琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化,将回收纯化产物采用T4 DNA连接酶进行连接并转化至BL-21感受态细胞中,构建真核表达质粒,将重组质粒命名为pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns).双酶切及测序鉴定正确后转染HEK-293细胞,采用PCR及Western blotting检测N^(pro)和E^(rns)在细胞内的表达.结果:pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns)真核表达质粒构建成功,N^(pro)和E^(rns)在HEK293细胞中成功表达.结论:N^(pro)、E^(rns)蛋白的成功表达可为探究蛋白质生物学功能、研究病毒感染机制及研制亚单位疫苗提供理论参考. 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 结构蛋白 真核表达
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BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定
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作者 柳凯月 董亚尊 +6 位作者 吴双双 马一瑄 刘鸿雁 王北艳 于立权 宋佰芬 马金柱 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期69-76,共8页
NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基... NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 ns4b基因 载体构建 蛋白表达
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基于小鼠模型研究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响 被引量:2
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作者 黄江 李闯 +6 位作者 崔月琦 袁雪莹 赵志诚 刘宇 周玉龙 朱战波 张泽财 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3466-3473,共8页
本试验通过建立肠道菌群紊乱小鼠模型,旨在探究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响。肠道菌群紊乱小鼠模型建立试验,共分为2组,采用两性霉素B、硫酸新霉素、氨苄西林、甲硝唑、盐酸万古霉素,以灌胃的方式构建肠道菌群紊乱小鼠模型,对照组... 本试验通过建立肠道菌群紊乱小鼠模型,旨在探究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响。肠道菌群紊乱小鼠模型建立试验,共分为2组,采用两性霉素B、硫酸新霉素、氨苄西林、甲硝唑、盐酸万古霉素,以灌胃的方式构建肠道菌群紊乱小鼠模型,对照组给予等体积的生理盐水。连续处理13 d后,无菌收集小鼠粪便,提取细菌DNA,进行16S rRNA测序,检测小鼠肠道菌群多样性和丰度的变化。肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响试验,共分为2组,抗生素处理组和未处理组小鼠均接种10^(5) TCID_(50)的CP型BVDV,于感染第7天,采集小鼠血液和十二指肠,通过qRT-PCR、Western blot方法检测病毒载量。通过苏木精-伊红染色法(HE染色)检测十二指肠病理组织变化。粪菌移植(FMT)移植试验共分为2组,以灌胃等体积生理盐水组为对照,进一步验证恢复肠道菌群对BVDV感染的影响。结果显示,抗生素处理明显降低肠道菌群α多样性,维恩图分析也表明抗生素处理减少肠道菌群OTU数量。β多样性结合柱形图分析进一步表明,抗生素处理组与未处理组小鼠肠道菌群的组成存在明显差异,其中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在抗生素处理组中均显著降低,然而变形菌门相对丰度明显增加。对BVDV易感性探究发现,菌群紊乱小鼠血液和十二指肠中BVDV载量均显著高于BVDV感染的菌群正常组小鼠的BVDV载量。Western blot和病理组织学检测也发现,肠道菌群紊乱增加了小鼠十二指肠中BVDV E0蛋白表达水平,加重了十二指肠病理损伤。FMT回补给菌群紊乱小鼠后,BVDV载量显著降低,十二指肠病理变化也明显改善。综上,本研究成功建立肠道菌群紊乱小鼠模型,依据该模型进一步证实了肠道菌群紊乱可以增加BVDV的易感性,而FMT回补具有抑制BVDV感染的作用。这些结果可为防控BVDV感染的微生态制剂研发以及抗病毒药物的筛选奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 肠道菌群 小鼠模型 粪菌移植
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An Indirect ELISA of Classical Swine Fever Virus Based on Quadruple Antigenic Epitope Peptide Expressed in E.coli 被引量:4
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作者 Guo-zhen LIN Fu-ying ZHENG Ji-zhang ZHOU Xiao-an CAO Xiao-wei GONG Guang-hua WANG Chang-qing QIU 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2010年第1期71-76,共6页
In this study,a synthesized quadruple antigenic epitope gene region of the classical swine fever virus (CSFV)E2 glycoprotein was expressed in E.coli to a obtain target protein.This target protein was used as a coating... In this study,a synthesized quadruple antigenic epitope gene region of the classical swine fever virus (CSFV)E2 glycoprotein was expressed in E.coli to a obtain target protein.This target protein was used as a coating antigen to establish an indirect ELISA for specifically detecting anti-CSFV antibodies in serum samples from pigs.The P/N cut-off value of this assay was 1.92 by receiver operating characteristic curve(ROC)analysis based on 30 negative sera and 80 positive samples.The test gave 97.5%sensitivity and 96.7%specificity compared with the indirect hemagglutination(IHA)test.The inter-assay and intra-assay coefficients of variation (CVs)for 16 sera were both≤6.8%.No cross-reactivity between the coating antigen and anti-bovine viral diarrhoea virus(BVDV)antibodies was observed. 展开更多
关键词 间接ELISA 猪瘟抗体 抗原表位 大肠杆菌 病毒基因 牛病毒性腹泻病毒 间接血凝试验 多肽
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Prevalence of coronavirus from diarrheic calves in the Republic of Korea 被引量:1
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作者 Jinho Park Du-Gyeong Han +4 位作者 Su Hee Kim Jeong-Byoung Chae Joon-Seok Chae Do-Hyeon Yu Kyoung-Seong Choi 《Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine》 SCIE CAS 2018年第1期1-6,共6页
Objective: To investigate the prevalence of bovine coronavirus(BCo V), bovine rotavirus, and bovine viral diarrhea virus in the feces of normal and diarrheic Korean native calves aged 1-81 days between April and Octob... Objective: To investigate the prevalence of bovine coronavirus(BCo V), bovine rotavirus, and bovine viral diarrhea virus in the feces of normal and diarrheic Korean native calves aged 1-81 days between April and October of 2016 in the Republic of Korea. Methods: Samples were obtained from 50 normal and 93 diarrheic(56 semi-formed, 28 loose, and 9 watery feces) calves in six different regions of northern and southern Korea. These fecal samples were tested for BCo V, bovine rotavirus, and bovine viral diarrhea virus by RT-PCR. Results: Among the three pathogens examined, infection with BCo V was especially prominent in relation to diarrhea among calves aged 1-21 days [odds ratio(OR)=9.3, 95% confidence interval(CI): 1.1-78.9; P=0.02). Infection with BCo V alone(OR=2.9; 95% CI: 1.1-7.6; P=0.03) or coinfection of BCo V with bovine viral diarrhea virus(OR=3.6; 95% CI: 1.0-12.4; P=0.04) was significantly associated with the development of loose feces. Grazing and colostrum intake strongly reduced the occurrence of diarrhea as compared to housed calves(OR=0.2; 95% CI: 0.1-0.4; P=0.00) and calves that had not been fed colostrum(OR=0.2; 95% CI: 0.1-0.7; P=0.02), respectively. Conclusions: The present study suggests that BCo V is involved in calf diarrhea in the Republic of Korea. Therefore, grazing and colostrum intake is recommended for preventing and controlling calf diarrhea caused by BCoV. 展开更多
关键词 Calf diarrhea bovine coronavirus bovine viral diarrhea virus Loose feces GRAZING
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基于E2蛋白BVDV-1病毒样颗粒的构建及对小鼠的免疫效力评估
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作者 张家祺 贾浠宁 +4 位作者 周群 宋鑫 朱晨曦 李格格 张斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期5143-5153,共11页
本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)E2病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E 2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E 2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达... 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)E2病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E 2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E 2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备BVDV-1 E2 VLPs。采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot验证E2蛋白在SF9细胞中的表达,通过电镜鉴定BVDV-1 E2 VLPs的组装。对获得的VLPs进行超离纯化,使用不同剂量的VLPs添加MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂肌注免疫小鼠,同时设立BVDV商业灭活苗组和PBS空白对照组。二免4周后选用BVDV-1 SWU-Z6毒株以灌胃途径对小鼠进行攻毒,通过小鼠体重变化以及粪便中的病毒载量来评估BVDV-1 E2 VLPs的免疫保护效果。经酶切鉴定和测序验证表明,优化后的E 2基因已正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Dual中,并获得重组质粒pFast Dual BVDV-1 E2,将重组质粒转化到DH10.Bac感受态细胞经过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-BVDV-1 E2,将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒Baculo-BVDV-1 E2。电镜下观察可见大量直径在80~100 nm的BVDV病毒样颗粒,IFA和Western blot结果证实重组杆状病毒能够正确表达E2蛋白,并具有良好的生物学活性。BVDV-1 E2 VLPs 50μg组小鼠首免2周时ELSIA抗体效价约为1∶10000,加强免疫2周后抗体效价达到1∶100000。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠在攻毒后第7天表现出体重下降,而后开始回升;在攻毒后第10天采集粪便没有检测到病毒拷贝。与非免疫组小鼠相对比,BVDV-1 E2 VLPs 50μg剂量两次免疫后阻止了因病毒感染而导致体重下降以及消化道内病毒的复制。研究中成功制备了BVDV-1 E2 VLPs,能诱导机体产生较强的体液免疫反应,可使小鼠获得抵抗BVDV-1 SWU-Z6毒株感染的免疫保护力。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 杆状病毒 病毒样颗粒 免疫原性
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BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:1
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作者 周思佳 韩佃刚 +5 位作者 董俊 杨云庆 叶玲玲 李静 张冲 信吉阁 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2023年第3期423-430,共8页
【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性... 【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒基因1型(bvdv-1) 实时荧光定量RT-PCR 病毒检测
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 刘丹 黄小洁 +5 位作者 吴华伟 孙淼 陈延飞 秦义娴 侯力丹 薛麒 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期51-56,共6页
为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 间接ELISA 抗体检测
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不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究
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作者 刘镝钺 程子龙 +8 位作者 陈益 陈思宇 李文良 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 熊富强 刘茂军 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第4期72-77,共6页
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 BALB/C小鼠 致病性 基因型
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牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定 被引量:22
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作者 张淑琴 郭利 +3 位作者 冷雪 张亭亭 吴永旺 武华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期181-184,共4页
本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-J... 本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-JL。将BVDV-JL株F4代细胞培养液(107.13TCID50/mL)经鼻内喷雾人工感染3月龄~6月龄BVDV抗体阴性黄牛(6mL/头),感染牛表现连续两天体温升高,白细胞数量下降,并在感染牛的白细胞提取物及鼻拭子样品中分离到该病毒株,表明该病毒株具有致病性。BVDV-JL株的分离对进一步开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理等方面的研究具有重要意义。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 无细胞病变 分离与鉴定
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BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立 被引量:6
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作者 刘晓乐 张敏敏 +3 位作者 陈颖钰 胡长敏 陈焕春 郭爱珍 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第11期1-5,共5页
参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件... 参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。 展开更多
关键词 双重PCR 检测方法 牛副流感病毒3型 牛病毒性腹泻病毒
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分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立 被引量:4
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作者 王新华 沈敏 +2 位作者 周鹏飞 钟发刚 温建新 《西北农业学报》 CAS CSCD 1999年第3期1-4,共4页
用牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 感染MDBK 细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上清经PEG 沉淀浓缩抗原免疫BALB/C小鼠,取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与SP2/O 细胞在PEG作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接... 用牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 感染MDBK 细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上清经PEG 沉淀浓缩抗原免疫BALB/C小鼠,取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与SP2/O 细胞在PEG作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ELISA 法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀释法克隆2 ~3次,得到8 株分泌抗BVDV 的单克隆抗体(McAb) 杂交瘤细胞株。8 株McAb 对BVDV、猪瘟(CSFV) 均呈阳性反应。杂交瘤细胞核内染色体数为98~105 条。McAb 属性为:6 株属IgG1 ,2 株属IgG2a 。经抗原结合位点分析,8 株McAb 可识别3 个不同的抗原决定位点。将杂交瘤细胞注射BALB/C 小鼠腹腔诱生腹水,其抗体效价提高3 200 倍以上,有3 株腹水单抗的ELISA 效价在1∶10 万以上,最高McAb 株达1∶20 万。杂交瘤在液氮中保存1~2 a 后复苏仍能稳定地分泌抗BVD 病毒的McAb 。所有腹水McAb 对BVDV 的中和指数均大于50(log101 .7),最高达50118(log104.7) 。McAb 展开更多
关键词 单克隆抗体 bvdv BDV CSFV
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牛病毒性腹泻病毒(BVDV)对牛免疫缺陷病毒(BIV)的激活作用 被引量:9
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作者 刘淑红 陈启民 +1 位作者 耿运琪 C Wood 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第3期229-234,共6页
通过合胞体分析和反转录酶活力测定,首次证明牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能激活牛免疫缺陷病毒(BIV)的复制与表达,并进一步通过转染实验和凝胶电泳漂移分析证明,当BIVLTR的NF-κB区缺失时,BVDV则不能实现其激... 通过合胞体分析和反转录酶活力测定,首次证明牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能激活牛免疫缺陷病毒(BIV)的复制与表达,并进一步通过转染实验和凝胶电泳漂移分析证明,当BIVLTR的NF-κB区缺失时,BVDV则不能实现其激活作用,BVDV直接或间接诱导牛NF-κB因子作用于BIVLTR的NF-κB区实现其激活作用。 展开更多
关键词 牛病 病毒性腹泻病毒 牛免疫缺陷病毒
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牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 被引量:4
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作者 钟发刚 黄新 +1 位作者 王新华 李娜 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期761-764,共4页
【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集... 【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度。【结果】重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7%,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测,检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55%。【结论】以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2重组蛋白 ELISA
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二重RT-PCR同时检测VSV与BVDV核酸 被引量:5
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作者 杨桂梅 徐自忠 +3 位作者 高洪 花群义 周晓黎 杨昌焰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期291-293,共3页
水泡性口炎病毒 (VSV)与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)具有相近的传播途径与类似的检测方法 ,本文参照文献报道的基因序列 ,设计合成了两对能分别扩增VSV( 2 0 2bp)、BVDV( 3 41bp)基因片段的引物 ,并对PCR扩增条件进行优化 ,建立了二重RT_PC... 水泡性口炎病毒 (VSV)与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)具有相近的传播途径与类似的检测方法 ,本文参照文献报道的基因序列 ,设计合成了两对能分别扩增VSV( 2 0 2bp)、BVDV( 3 41bp)基因片段的引物 ,并对PCR扩增条件进行优化 ,建立了二重RT_PCR方法 ,可同时检测VSV与BVDV病毒核酸。VSV产物经测序显示与报道的核酸序列同源性为88 6%。二重RT_PCR同时检测VSV与BVDV经济、快速、敏感、特异 ,可用于实验研究和流行病学调查。 展开更多
关键词 二重聚合酶链反应 水泡性口炎病毒 牛病毒性腹泻病毒
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牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析 被引量:9
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作者 张淑琴 谭斌 +1 位作者 王凤雪 程世鹏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第10期23-27,共5页
为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株... 为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株的7段cDNA片段,分别克隆于pMD18-T载体并进行测序。BVDV-JL株基因组序列全长为12276bp,编码3901个氨基酸。基因组两端为非编码区5′UTR和3′UTR。基因比对及进化树分析结果表明BVDV-JL与BVDV CP7同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,归类于BVDV-1b2基因亚型。BVDV-JL是第1个在中国报道的BVDV-1b2亚型毒株。了解BVDV-JL完整基因序列有利于中国BVDV流行病学调查。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 全基因组 进化树
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BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用 被引量:3
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作者 马鹏 李林杰 +5 位作者 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第A01期49-53,共5页
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的R... 利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) RT-PCR SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 应用
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牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备
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作者 王静 陈柯源 +5 位作者 王胜华 丁成志 杨光辉 刘一 尹金花 王九峰 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期65-70,共6页
为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试... 为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E^(rns)蛋白 抗体 间接ELISA
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江浙部分地区牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查及BVDV-2型毒株分离鉴定 被引量:14
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作者 姚志兰 傅宏庆 +1 位作者 崔平福 宗佳丽 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS 北大核心 2019年第1期40-46,102,共8页
为了解江浙地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的流行情况,于2016~2017年在江浙部分地区采集了145份临床腹泻犊奶牛血清样品,并对其进行RT-PCR检测,对阳性样品的5′-UTR和N^(pro)基因进行序列与遗传进化树分析。145份血清样品中共有19份样品为... 为了解江浙地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的流行情况,于2016~2017年在江浙部分地区采集了145份临床腹泻犊奶牛血清样品,并对其进行RT-PCR检测,对阳性样品的5′-UTR和N^(pro)基因进行序列与遗传进化树分析。145份血清样品中共有19份样品为BVDV阳性,阳性率为13.1%,其中江苏和浙江地区的阳性率分别为14.1%和11.9%。根据阳性样品的5′-UTR和N^(pro)基因序列进行遗传进化树分析,18份样品为BVDV-1型,包括1a(n=2)、1b(n=6)、1c(n=2)、1m (n=7)和1q(n=1)亚型;1份样品为BVDV-2型,其5′-UTR和N^(pro)基因序列分析均显示与我国吉林分离株BVDV-2SD1301同源性最高,分别为99.0%与97.0%。同时,对BVDV-2型阳性样品进行病毒分离、RTPCR检测和IFA鉴定,证实成功分离到1株非致细胞病变型(ncp)BVDV-2病毒,命名为BVDV-2JZ21。结果表明:江浙部分地区存在较高比例的BVDV感染,且基因型多样,其中BVDV-1b与1m亚型为该地区感染的主要亚型,分别占33.3%和38.9%。此外,该地区已存在BVDV-2感染。这一研究丰富了BVDV的分子流行病学数据,也为BVDV疫苗研制提供了一定的理论基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 分子流行病学 分型
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