甜蛋白Brazzein基因在番茄果实中的特异表达

西瓜(Citrullus vulgaris S.)来源的AGPL1启动子在番茄(Lycopersicon esculentum L.)果实中具有较强的特异性驱动功能。将该启动子与甜味蛋白基因Brazzein融合构建植物表达载体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法成功地进行了对番茄的遗传转化,获得转化植株。组织化学法、PCR特异扩增、Southern杂交分析及RT-PCR检测,表明Brazzein基因已整合到转基因番茄植株基因组中并且稳定表达。通过AGPL1果实特异启动子的调控,在不改变果实其他性状的前提下提高了番茄果实甜味品质,并为甜蛋白的生产提供经验。

甜味蛋白(brazzein)基因的人工合成及其在大肠杆菌中的重组表达

根据从西非植物Pentadiplandra brazzeanaBaillion果实中分离的甜味蛋白brazzein的成熟区氨基酸序列,采用大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱的密码子,人工合成了5对寡聚核苷酸序列,经体外连接和PCR扩增后得到了187 bp的brazzein的编码序列,将该序列插入pET-28a载体构建成重组表达载体pET-Br。将pET-Br转化至大肠杆菌BL-21细胞,诱导表达后得到了与预计相对分子质量相同的蛋白。该蛋白约占细菌可溶性蛋白的18.9%,分离纯化后通过蛋白复性,得到有微甜味的产物。

乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立

参照甜味蛋白Brazzein基因序列,结合乳酸乳球菌的密码子偏嗜性的相关分析,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,将第29位天冬氨酸、31位的组氨酸和第41位的谷氨酸分别突变为赖氨酸、丙氨酸和赖氨酸,以期提高目的蛋白的甜度。采用重叠PCR的方法合成目的基因,目的片段亚克隆到pMD18-T载体上。经序列测定分析后,目的片段克隆入分泌表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌中,构建成表面展示表达甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表达系统。

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoRI和NotI双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子。0.5%甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg/L。

耐热甜味蛋白Brazzein的特性和化学修饰

ＭｉｎｇａｎｄＨｅｌｌｅｋａｎｔ（１９９４）从西非洲热带野生植物ＰｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａｂｒａｚｚｅａｎａＢａｉｌｌ．的果实中，分离出一种甜味蛋白质，命名为ｂｒａｚｚｅｉｎ，它是由５４个氨基酸残基组成的单链多肽；甜度是蔗糖的２０００倍。本实验测得Ｂｒａｚｚｅｉｎ分子量为６．５ｋＤ，等电点为５。Ｂｒａｚｚｅｉｎ含有８个半胱氨酸，构成分子内的双硫键；其水溶液经８０℃，４ｈ处理，甜味和电泳行为不变。虽然Ｂｒａｚｚｅｉｎ的氨基酸序列与芥菜蛋白酶抑制剂ＭＴＩ－２有高的同源性，但未测出有蛋白酶抑制剂活性。根据氨基酸序列的计算机分析表明：Ｂｒａｚｚｅｉｎ是亲水性多肽；二级结构主要是月一折迭和产一转角。蛋白质印迹分析显示，Ｂｒａｚｚｅｉｎ抗血清与甜味蛋白ｃｕｒｃｕｌｉｎ，ｍａｂｉｎｌｉｎ和ｍｉｒａｃｕｌｉｎ有强的交叉反应。Ｂｒａｚｚｅｉｎ的Ｓ－烷基化修饰引起甜味的丧失，同时也丧失与抗血清的免疫反应。Ｂｒａｚｚｅｉｎ中赖氨酸ε－氨基的酰化，酪氨酸酚羟基的碘化，组氨酸咪唑基和精氨酸肌基的修饰均导致甜味的丧失或降低；但赖氨酸ε－氨基的甲基化只改变其电泳行为，却不降低甜味。这表明Ｂｒａｚｚｅｉｎ分子的表面电荷对于其甜味性质是重?

Brazzein:一种耐热的甜味蛋白

Brazzein是从非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中提取的一种甜味蛋白。Brazzein由54个氨基酸残基组成,Mr为6500,等电点为5,并且具有很好的热稳定性。本文着重概述Brazzein的结构与功能的关系,及其在基因工程中的研究前景。

用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。

甜味蛋白Brazzein的研究进展

Brazzein是从非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中提取的一种甜味蛋白。在所有已知的甜味蛋白质中,Brazzein的分子量最小,水溶性最好,并且具有很好的热稳定性。着重概述了Brazzein的结构及其与功能的关系,并对它在基因工程方面的研究进展进行了详细的叙述。

甜味蛋白Brazzein的特性及其应用

甜味蛋白是一类高甜度低热量的天然甜味剂。介绍甜味蛋白Brazzein的基本性质、结构与功能的关系,并着重概述了基因工程技术开发研究甜蛋白的进展及其应用前景。

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞。[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度(400μg/ml)筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的"S";转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中。[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株。

甜味蛋白Brazzein基因合成及其在酵母中表达的初步研究

采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入Pichia.pastoris SMD1168中,用高浓度的Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌,SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,诱导72h后的目的蛋白表达量达0.12g/L。

甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。

植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达

根据大肠杆菌偏爱的密码子,利用PCR技术体外人工合成brazzeincDNA序列,并将其克隆至原核高效表达载体pET30a(+)中。重组载体pET30a(+)-brazzein转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果证明pET30a(+)-brazzein在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白25%左右。

乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建

为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。

人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表达菌的诱导条件优化及其活性分析

对人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG诱导表达条件进行了研究,同时对所表达的目的蛋白进行了纯化和活性分析。IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示:所取的IPTG浓度(0.2～1.0mmol/L)对菌株生长和目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);菌株的生物量随着诱导时间的延长而增加,6h优于4h(P<0.01),但是蛋白的表达量无明显增加(P>0.05);其中温度是重要的影响因素,在30℃诱导时,目的蛋白的表达量占总蛋白的35%左右。进一步的研究表明,菌株在30℃～32℃生长,在30℃诱导最优。对目的蛋白的活性分析表明,所得到的hBD3-Bra融合蛋白有甜味,其甜度大约是蔗糖的200倍,但是其杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,des-pGlu1-Brazzein的甜度大大提高,大约为蔗糖甜度的600倍,重组hBD3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性。

乳糖诱导植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein在大肠杆菌中的表达

构建了植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein高效表达的工程菌株,对其乳糖诱导条件进行了优化。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),时间延长对于菌株生长有利(P<0.01),对目的蛋白的表达因温度不同而不同。进一步的研究表明,以0.5%乳糖在28℃～30℃诱导4h对菌株生长和目的蛋白的表达有利,目的蛋白的表达量可达20%左右。

利用毕赤酵母表达植物甜蛋白(brazzein)的初步研究

实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母(Pichiapastori)GS115中,并从22个阳性克隆中筛选出His+Muts高拷贝转化子2个,经诱导表达,产物进行Tricine SDS PAGE电泳鉴定,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,又经小试(5～10L罐)蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离,得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了1D NMR图谱。

甜味蛋白Brazzein及其基因工程

Brazzein是一种天然植物甜味蛋白,具有甜度高、能量低、稳定性好等优点。文章综述了其来源、生化特性和其甜味决定因素,并对它在基因工程方面的研究进展进行了综述。

植物Brazzein基因的合成及其克隆

根据从西非植物PentadiplandrabrazzeanaBaillion果实中分离的甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列,按照酵母密码子偏好人工合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列,经连接、PCR扩增后得到了179bp的Brazzein类似物的编码序列,插入到pPIC9K载体构建成重组表达载体pPIC9K Bra.