松针褐斑病菌的产毒培养和毒素粗提方法

松针褐斑病菌在PD和MS培养基中生长良好 ,能产生毒素。在这两种培养基中加入敏感寄主火炬松的针叶浸汁对毒素的产生和活性没有明显影响。甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿甲醇 (氯仿∶甲醇 =2∶3)混合溶剂等均能把毒素物质充分提取出来 ,苯、氯仿、乙酸乙酯等极性小的溶剂不能充分提取毒素。通过生测和高效液相 (HPLC)比较分析表明 ,采用MS培养液培养病菌 ,以氯仿甲醇混合溶剂提取毒素 ,将有利于毒素的产生和毒素的分离。

松针褐斑病菌毒素对寄主细胞质膜伤害机理的研究

用毒素粗提液处理寄主愈伤组织 2d后 ,可于光学显微镜下观察到严重的细胞原生质泡囊化现象 ,这是寄主受到毒素作用后于细胞水平所表现出的伤害症状。经毒素诱导后用ESR仪检测 ,寄主愈伤组织于 2h内即可产生比对照高得多的超氧阴离子自由基 ,继而诱发膜脂脂过氧化反应 ;随着毒素作用时间的延长 ,寄主细胞膜脂脂肪酸组成发生变化 ,总的变化趋势为不饱和脂肪酸含量减少 ,饱和脂肪酸含量增加 ;毒素作用后于 4h以内即可产生大量的MDA ,6h内则可检测到严重的离子渗漏 ,造成膜的破坏 。

松针褐斑病菌毒素活性的生物检测

松针褐斑病菌毒素不仅能伤害湿地松、火炬松等寄主植物的幼苗、针叶、根及愈伤组织 ,对非寄主植物水花生、紫茎泽兰的叶片也有伤害作用。在试验的几种生测材料中 ,湿地松愈伤组织对毒素伤害最敏感 ,湿地松幼苗、幼针叶 ,火炬松幼针叶和紫茎泽兰叶片次之 ,湿地松幼根、老针叶 ,火炬松老针叶 ,水花生和小麦叶片最不敏感。根据生测材料的敏感程度及表现症状的特异性分析可知 ,用湿地松、火炬松幼苗和幼针叶作生测材料较好。比较针刺法、浸渍法和涂抹法等几种生测方法表明 ,用针刺法接种毒素效果最好 ,其反应速度快 ,用量少 ,症状明显。因此建议在松针褐斑病菌毒素的生物检测中 ,以湿地松或火炬松幼苗或幼针叶作为材料 。

松针褐斑病菌毒素的专化性研究

用松针褐斑病菌毒素粗提液处理湿地松、火炬松、黑松和马尾松的切根苗，发现湿地松和火炬松对毒素最为敏感，其次为马尾松，黑松最不敏感。毒素生测的结果与松树在田间自然感染的情况有一定的相似性，但不完全一致。不同湿地松抗病无性系对毒素的反应存在着差别，其中３３ 号所受伤害较轻，１０ 号及３６ 号较重。结合毒素薄层层析半定量试验，利用寄主愈伤组织对毒素的反应，发现毒素对寄主愈伤组织的最低作用浓度应在１００ μｇ／ｍ Ｌ 以下。试验了５ 种杂草对毒素的反应，其中空心莲子草和稞草对毒素敏感。进一步研究利用毒素作为除草剂不失为毒素利用的一个新思路。上述研究表明该毒素为非寄主专化性毒素。

松针水抽提物及其酸度与抗褐斑病的关系

本研究表明，松针褐斑病菌（Ｌｅｃａｎｏｓｔｉｃｔａａｃｉｃｏｌａ）在抗性不同的松针水抽提液中的生长情况明显不同。病菌分生孢子在抗病的湿地松（Ｐｉｎｕｓｅｌｌｉｏｔｉｉ）、马尾松（Ｐ．ｍａｓｓｏｎｉａｎａ）以及易感的湿地松和黑松（Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）的松针水抽滤液中的萌发率分别为３８．７％、４６．１％、５１．９％和５５．２％。菌丝在抗病的松针抽滤液中生长也远不及在易感松针的抽滤液中好。抗病和易感湿地松针叶的ｐＨ值和缓冲容量几乎完全相同，马尾松和黑松的松针抽滤液的ｐＨ比湿地松略高些，但缓冲容量比抗病和易感湿地松都小，显然，湿地松对松针褐斑病的抗性与松针中的某些水抽提物质存在一定联系，但与其ｐＨ值和缓冲容量无关。

抗松针褐斑病湿地松未成熟合子胚胚性愈伤组织的诱导

【目的】建立高效实用的抗松针褐斑病湿地松优良无性系的离体快繁体系,为湿地松优良种苗的商业化应用提供技术基础。【方法】以福建官庄林场采集的抗松针褐斑病家系湿地松未成熟合子胚为外植体,分析影响湿地松胚性愈伤组织诱导的主要因素:对外植体材料的预处理进行研究,利用单因素实验筛选适合湿地松未成熟球果的采集及冷藏时间;对培养基中影响胚性愈伤组织诱导的主要添加物中的碳源(麦芽糖、蔗糖和葡萄糖)、肌醇和抗坏血酸进行单因素实验,对α-酮戊二酸和丙酮酸进行双因素实验分析;最后对影响胚性愈伤组织诱导的主要激素,如生长素(2,4-二氯苯氧乙酸)和细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤和激动素)进行随机组合分析。【结果】(1)未成熟湿地松球果体胚最佳诱导时间为6月底至7月中上旬;(2)1000 mg/L肌醇和30 g/L麦芽糖最适宜湿地松胚性愈伤组织的诱导;(3)抗坏血酸质量浓度为0、1、2、3 mg/L时,对湿地松胚性愈伤组织诱导的影响区别不大;但同时添加α-酮戊二酸和丙酮酸时明显促进了湿地松愈伤组织的诱导;(4)湿地松最佳诱导培养基与激素组合为基本培养基LP+2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+2 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+2.5 mg/L激动素(KT)。【结论】通过对湿地松球果的预处理,获得了适合湿地松愈伤组织诱导的材料,并且确定了适合胚性愈伤组织诱导的合子胚发育阶段,即2~4阶段,以及合适的采集期。另外,对诱导培养基中主要添加物和激素进行研究,筛选出了1种较优的湿地松愈伤组织诱导的培养基,确定了适合湿地松胚性愈伤组织诱导的主要条件,可为提高湿地松胚性愈伤组织诱导率、促进湿地松体胚发生提供参考。