牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系,本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析,并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UT R可能存在的结合位点,然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区(3’UTR)片段,并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒,并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至人胚肾细胞(HEK 293T细胞)中,检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACU G;Target scan预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因,其中包括612个保守位点和190个低保守位点,并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点;构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带,测序结果与预期一致,说明质粒构建成功;bta-miR-22-3p mimics能够显著降低(P<0.01)KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明,牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

急性脑梗死患者血清miR-22-3p、NLRP3水平与炎性因子及预后不良的关系

目的探讨急性脑梗死(ACI)患者血清微小核糖核酸-22-3p(miR-22-3p)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)水平与炎性因子及预后不良的关系。方法选取2021年1月—2022年12月上海中医药大学附属第七人民医院神经内科收治ACI患者106例为ACI组,根据预后情况分为预后不良亚组37例和预后良好亚组69例,另选取同期体检健康者60例为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测血清miR-22-3p水平,酶联免疫吸附法检测血清NLRP3和炎性因子[白介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平。通过Pearson相关性分析ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3与IL-1β、IL-18、TNF-α的相关性。分析ACI患者预后不良的影响因素,绘制2项指标的受试者工作特征(ROC)曲线分析其预测预后的价值。结果与健康对照组比较,ACI组血清miR-22-3p水平降低,NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平显著升高(t/P=18.698/<0.001、27.091/<0.001、30.154/<0.001、35.104/<0.001、39.834/<0.001)。Pearson相关性分析显示,ACI患者血清miR-22-3p与NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈负相关(r/P=-0.733/<0.001、-0.719/<0.001、-0.683/<0.001、-0.680/<0.001),血清NLRP3与IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈正相关(r/P=0.716/<0.001、0.715/<0.001、0.707/<0.001)。多因素Logistic回归分析显示,NIHSS评分、IL-1β、IL-18、TNF-α、NLRP3升高为ACI患者预后不良的独立危险因素[OR(95%CI)=1.244(1.034~1.497)、1.373(1.067~1.767)、1.047(1.011~1.086)、1.577(1.061~2.343)、1.084(1.022~1.149)],miR-22-3p升高为独立保护因素[OR(95%CI)=0.933(0.888~0.980)]。ROC曲线分析显示,血清miR-22-3p、NLRP3水平联合预测ACI患者预后不良的曲线下面积为0.875,大于两者单独预测的0.786、0.759(Z/P=2.405/0.016、2.517/0.012)。结论ACI患者血清miR-22-3p水平降低和NLRP3水平升高,与炎性因子水平升高和预后不良密切相关,血清miR-22-3p、NLRP3水平联合对ACI患者预后不良的预测价值较高。

miR-22-3p靶向GSDMD抑制同型半胱氨酸诱导的平滑肌细胞焦亡

目的探讨miR-22-3p对同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞焦亡的影响。方法体外培养人血管平滑肌细胞(VSMC),分为Control组(0μmol/L Hcy)与Hcy组(100μmol/L Hcy),Western blot检测细胞中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平,qRT-PCR检测miR-22-3p表达情况;ELISA检测上清中IL-1β、IL-18的浓度。转染miR-22-3p对照(miR-22-3p-NC)、miR-22-3p的模拟物(miR-22-3p-mimic)及抑制物(miR-22-3p-inhibitor)后观察Hcy诱导下VSMC的变化。结果与Control组相比,Hcy组VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平增加(P<0.05),IL-1β、IL-18浓度更高(P<0.01),miR-22-3p相对表达水平低(P<0.01);转染miR-22-3p-mimic后,VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平显著降低(P<0.01),IL-1β、IL-18浓度降低(P<0.01);转染miR-22-3p-inhibitor后VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平显著增加(P<0.01),IL-1β、IL-18浓度升高(P<0.05)。结论miR-22-3p可抑制Hcy诱导的VSMC焦亡。

miR-132-3p靶向调控PTEN/Akt信号通路对缺氧/复氧诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响

目的研究miR-132-3p靶向调控第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对缺氧/复氧(H/R)诱导海马神经元HT22细胞损伤的影响。方法体外培养HT22细胞并随机分为对照组、H/R组、阴性对照(miR-132-3p mimics阴性对照+空载质粒)组、miR-132-3p mimics组(miR-132-3p mimics)、PTEN敲低组(PTEN siRNA质粒)、miR-132-3p mimics+PTEN过表达组(miR-132-3p mimics+PTEN过表达质粒),除对照组外,其余各组进行H/R处理,同时进行分组转染,然后采用qRT-PCR实验、免疫印迹法检测各组细胞miR-132-3p与PTEN/Akt通路相关蛋白表达;采用MTT法、TUNEL染色分别检测各组细胞增殖与凋亡情况;采用试剂盒测量各组细胞活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-18水平;采用免疫印迹法检测各组细胞凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)表达;采用双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p对HT22细胞PTEN的靶向调控。结果与对照组相比,H/R组细胞miR-132-3p表达、p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与H/R组相比,miR-132-3p mimics组、PTEN敲低组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力升高(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);阴性对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。与miR-132-3p mimics相比,miR-132-3p mimics+PTEN过表达组p-Akt/Akt、GSH-Px与SOD水平、Bcl-2蛋白表达、细胞活力降低(P<0.05),细胞凋亡率、PTEN mRNA与蛋白表达、ROS相对水平、LDH产生水平、IL-6与IL-18水平、Bax与Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。miR-132-3p可靶向下调HT22细胞PTEN表达。结论miR-132-3p可通过靶向下调PTEN表达而激活Akt信号,进而抑制H/R诱导的HT22细胞炎症与凋亡,缓解其细胞损伤。

hsa-miR-22-3p靶基因预测及功能分析

本研究旨在通过生物信息学分析,预测和验证hsa-miR-22-3p的靶基因,并探讨其在不同物种、组织和信号通路中的功能。方法 本研究利用了多种在线数据库和软件,如miRBase、ClustalOmega、Cytoscape3.6.1等,进行了对不同物种间的miR-22-3p保守性分析。预测hsa-miR-22-3p的靶基因,绘制Venn图,得到交集靶基因集合。对交集靶基因进行GO功能注释和KEGG Pathway富集分析,探索其在生物过程和信号通路中的作用。预测交集靶基因编码蛋白质之间的相互作用关系,构建蛋白蛋白互作网络图谱,筛选出核心基因。结果 miR-22-3p是一种在多种生物中高度保守的miRNA,与心肌细胞分化和心血管疾病密切相关。hsa-miR-22-3p的36个交集靶基因在肿瘤、淋巴和腹腔等组织中表达较高,参与了组蛋白修饰、染色质重构、低氧应答等276个生物学过程,在乳腺癌、雌激素、FoxO、破骨细胞分化、肿瘤、PI3KAkt等8个信号通路中显著富集。hsa-miR-22-3p的10个核心基因ESR1、SIRT1、PTEN、CREB1、SP1、HDAC4、MECP2、YWHAZ、MAPK14、SNAI1在多种疾病中发挥重要作用,如肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、炎症、衰老、心肌肥厚、心肌缺血再灌注、心房纤维化、动脉粥样硬化等。结论 本研究为hsa-miR-22-3p在肿瘤、心血管等多种疾病中的关键调控机制提供了新的理解,也为肿瘤、心血管等疾病的早期诊疗提供了新的思路。

异甘草素通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移的机制研究

目的 肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)是全世界范围内高频率发生的恶性肿瘤。最近的研究表明,异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)在肿瘤增殖和转移中发挥抗肿瘤活性。因此,研究旨在探讨ISL在抗LUSC转移中的作用机制。方法 利用梯度浓度ISL处理LUSC细胞,探究ISL在LUSC细胞增殖、迁移和侵袭中的抗癌特性。随后,利用生物信息学手段探寻了长链非编码RNA(Long non-coding RNAs, lncRNA)MIR22HG/miR-24-3p/Fas配体基因(Fas ligand Gene,FASLG)之间可能的互作关系。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测LUSC细胞中lncRNA MIR22HG、miR-24-3p、FASLG的表达,细胞计数盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验分别检测细胞活力、增殖、迁移和侵袭。蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测上皮间充质转换(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移相关蛋白的表达。RNA免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RIP)实验和双萤光素酶实验验证lncRNA MIR22HG与miR-24-3p、miR-24-3p与FASLG的结合关系。结果 ISL可以显著抑制LUSC细胞增殖、迁移和侵袭。生信分析及临床样本分析发现lncRNA MIR22HG在LUSC中低表达,ISL可以促进lncRNA MIR22HG的表达,抑制LUSC细胞的恶性行为。此外,lncRNA MIR22HG可以海绵吸附miR-24-3p进而调节FASLG的表达。miR-24-3p在LUSC中上调表达,FASLG在LUSC中下调表达。过表达FASLG可以逆转miR-24-3p过表达对LUSC增殖、转移以及EMT进程的促进作用。结论 这些结果表明,ISL通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移,表明ISL有潜力作为治疗LUSC的新型药物。

血清miR-22-3p、CYR61水平对乳腺癌诊断及复发转移预测的临床价值

目的探讨血清微小RNA-22-3p(miR-22-3p)、富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)水平对乳腺癌诊断及复发转移预测的临床价值。方法选择乳腺癌患者110例(观察组),接受改良根治术后随访1年,发生复发转移25例、未发生复发转移85例,同期选择乳腺良性疾病患者110例(对照组),采集所有研究对象外周静脉血,离心留取血清,采用RT-qPCR法检测血清miR-22-3p、采用ELISA法检测血清CYR61。比较观察组与对照组、复发转移者与未复发转移者血清miR-22-3p、CYR61水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-22-3p、CYR61水平对乳腺癌诊断及复发转移预测的临床价值。采用Pearson相关分析法分析乳腺癌患者血清miR-22-3p水平与血清CYR61水平的关系。结果观察组与对照组血清miR-22-3p水平分别为0.65±0.14、1.02±0.23,血清CYR61水平分别为(128.63±25.72)、(96.45±17.31)μg/L。观察组血清miR-22-3p水平低于对照组,血清CYR61水平高于对照组(t分别为14.802、10.886,P均<0.01)。ROC曲线分析显示,血清miR-22-3p、CYR61水平单独及联合诊断乳腺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.917、0.857、0.960,血清miR-22-3p、CYR61水平联合诊断乳腺癌的AUC高于二者单独(Z分别为3.321、4.512,P均<0.05)。乳腺癌复发转移者与未复发转移者血清miR-22-3p水平分别为0.45±0.12、0.71±0.24,血清CYR61水平分别为(162.94±29.78)、(118.53±25.49)μg/L。乳腺癌复发转移者血清miR-22-3p水平低于未复发转移者,血清CYR61水平高于未复发转移者(t分别为5.216、7.365,P均<0.01)。血清miR-22-3p、CYR61水平单独及联合预测乳腺癌复发转移的AUC分别为0.838、0.831、0.932,血清miR-22-3p、CYR61水平联合预测乳腺癌复发转移的AUC高于二者单独(Z分别为2.493、2.196,P均<0.05)。Pearson相关分析显示,乳腺癌患者血清miR-22-3p水平与血清CYR61水平呈负相关关系(r=-0.643,P<0.05)。结论血清miR-22-3p、CYR61水平对乳腺癌诊断及复发转移预测均有一定临床价值,二者联合临床价值更高。

骨髓间充质干细胞来源外泌体的微小RNA-22-3p参与抑制环磷酰胺诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制研究

目的分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对卵巢早衰的影响。方法选取接受体外受精或者第二代试管婴儿治疗的卵巢早衰患者以及接受同样治疗的因男性因素不孕的正常志愿者提供卵泡液;通过差速离心法分离骨髓间充质干细胞来源外泌体;分离外泌体的形态学、粒子大小以及标志蛋白通过透射电子显微镜、NanoSight LM10分析仪以及蛋白免疫印迹方法进行分析。将颗粒细胞经环磷酰胺(CTX)、外泌体、miR-22-3p模拟物以及相应对照处理,分为CTX组、Control组、外泌体孵育组、PBS处理组、CTX+miR-22-3p组、CTX+miR-NC组、CTX+Exosomes组以及CTX+PBS组;采用蛋白免疫印迹法和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达水平;利用二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂以及流式分析仪检测细胞活力和凋亡。结果提取的外泌体具有典型的杯状囊泡,外泌体标志蛋白簇状分化抗原63(CD63)和簇状分化抗原9(CD9)表达在所提取的细胞上清外泌体中,外泌体粒子大小为80~150 nm;miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX诱导的卵巢颗粒细胞中显著低表达(P<0.05),在骨髓间充质干细胞来源外泌体孵育卵巢颗粒细胞中显著高表达(P<0.05);颗粒细胞活力在CTX组低于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-22-3p抑制CTX诱导的卵巢颗粒细胞损伤。

长链非编码RNAMIR22HG和微RNA-9-3p在骨关节炎病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MIR22HG和微RNA-9-3p(miR-9-3p)在骨关节炎(OA)病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性。方法 选取2020年10月至2021年10月在南充市中医医院确诊为OA的病人120例,作为OA组,60例体检健康人群作为对照组;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平;Pearson法分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的相关性以及二者与视觉模拟(VAS)评分、美国特种外科医院膝关节评分(HSS)以及西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(WOMAC)评分的相关性;绘制受试者操作特征(ROC)曲线分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p对OA的诊断价值。结果 OA组的血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著高于对照组(1.48±0.25比1.01±0.22),miR-9-3p的表达水平显著低于对照组(0.72±0.13比1.05±0.12)(P<0.05);相关性分析显示,lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平呈负相关关系(P<0.05);KLⅣ级血清lncRNA MIR22HG的表达水平、VAS评分、WOMAC评分显著高于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著高于KLⅡ级(P<0.05),KLⅣ级血清miR-9-3p的表达水平、HSS评分显著低于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著低于KLⅡ级(P<0.05);OA病人lncRNA MIR22HG的表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈正相关,与HSS评分呈负相关(P<0.05);miR-9-3p表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈负相关,与HSS评分呈正相关(P<0.05);二者联合诊断的AUC高于lncRNA MIR22HG、miR-9-3p单独诊断的AUC值(Z=2.22,P=0.012;Z=1.43,P=0.025)。结论OA病人血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著升高,miR-9-3p表达水平显著降低,二者与OA病情严重程度密切相关,且对OA具有一定的诊断价值。

微小RNA-22-3p抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化

目的:探讨微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对人肾小管上皮细胞NLRP3活化的影响。方法:将包含NLRP3基因3’-非编码区(3’-UTR)序列的野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒(psiCHECK2)分别与miR-22-3p mimic(模拟物)、miR-22-3p inhibitor(抑制物)共转染人肾小管上皮细胞株(HK-2),检测细胞荧光素酶活性;HK-2细胞随机分组如下:(1)正常对照组;(2)miR-22-3p mimic+LPS+ATP组;(3)miR-22-3p control+LPS+ATP组;(4)miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组;(5)miR-22-3p mimic+LPS组;(6)miR-22-3p control+LPS组;(7)miR-22-3p inhibitor+LPS组,采用定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹(WB)分别检测NLRP3 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测白介素-1β(IL-1β)水平及半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)活性。结果:NLRP3-3’UTR野生型分别与miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor共转染HK-2细胞后,与对照组比较,荧光素酶活性分别出现降低与升高(P<0.05)。此外,与miR-22-3p control+LPS组比较,miR-22-3p mimic+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05);与miR-22-3p control+LPS+ATP组比较,miR-22-3p mimic+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05)。结论:miR-22-3p可抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化。

HCG22靶向miR-17-3p对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响

目的探讨HLA基因复合体22(HCG22)通过调控微小RNA-17-3p(miR-17-3p)对口腔鳞癌(OSCC)细胞生物学行为的影响。方法通过实时定量PCR(qPCR)检测OSCC组织和细胞系中HCG22和miR-17-3p的表达。双荧光素酶报告基因实验检测HCG22和miR-17-3p之间的相互作用。在OSCC细胞SCC-9中转染pcDNA3.1-HCG22过表达载体和miR-17-3p模拟物mimics,将细胞分为control组(空白)、pcDNA3.1-HCG22组(过表达HCG22)、miR-17-3p mimics组(过表达miR-17-3p)和pcDNA3.1-HCG22+miR-17-3p mimics组(过表达HCG22和miR-17-3p)。MTT、划痕愈合和Transwell法分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过qPCR和Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9的表达。结果OSCC组织中HCG22表达下调,而miR-17-3p表达上调,且两者表达呈负相关(r=-0.794,P<0.05)。与NHOK细胞相比,SCC-15、CAL-27、SCC-6和SCC-9细胞中HCG22低表达,而miR-17-3p高表达(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实HCG22能够与miR-17-3p靶向作用。pcDNA3.1-HCG22组SCC-9细胞的miR-17-3p表达水平低于pcDNA3.1组(P<0.05)。与control组比较,pcDNA3.1-HCG22组SCC-9细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制,而miR-17-3p mimics组SCC-9细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。挽救实验显示,miR-17-3p mimics可抵消pcDNA3.1-HCG22诱导SCC-9细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。pcDNA3.1-HCG22组的MMP-2和MMP-9水平降低(P<0.05),而miR-17-3p mimics组的MMP-2和MMP-9水平上调(P<0.05)。与pcDNA3.1-HCG22组相比,pcDNA3.1-HCG22+miR-17-3p mimics组的MMP-2和MMP-9水平均升高(P<0.05)。结论HCG22可能通过靶向抑制miR-17-3p表达调控OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭过程。HCG22/miR-17-3p轴在OSCC中可能存在负反馈回路。

基于微RNA-22-3p探讨双醋瑞因联合依托考昔治疗痛风性关节炎的作用机制

目的 基于微RNA(miR)-22-3p探讨双醋瑞因联合依托考昔治疗痛风性关节炎的作用机制,为临床应用提供依据。方法 选择秦皇岛市第一医院2021年3—9月收治的80例病人并依照随机信封法分为观察组和对照组;对照组给予依托考昔治疗,在对照组基础上观察组给予双醋瑞因治疗,同期选择50例高尿酸血症病人作为高尿酸组;参照《中药新药临床指导原则》中标准对病人治疗临床疗效进行判断,治疗前及治疗后对病人关节疼痛、症状体征积分进行调查;治疗前及治疗后检测受试者C反应蛋白(CRP)、血沉、肌酐、尿酸、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8水平;检测外周血中单个核细胞(PBMCs)中miR-22-3p表达情况;采用Spearman相关性检验分析miR-22-3p探讨双醋瑞因联合依托考昔治疗痛风性关节炎疗效相关性,采用线性回归模型分析miR-22-3p与尿酸水平关系。结果 观察组总有效率97.50%高于对照组90.00%(P<0.05);治疗后观察组病人数字等级量表(NRS-11)及症状体征积分均明显低于对照组(5.33±0.91)分比(3.12±0.87)分;(4.83±0.77)分比(3.81±0.84)分,(P<0.05);治疗后观察组病人CRP、血沉、肌酐、尿酸均明显低于对照组(14.85±1.22)mg/L比(10.42±1.02)mg/L,(18.43±1.84)mm/h比(14.85±1.12)mm/h,(84.35±1.93)μmol/L比(81.20±1.84)μmol/L,(408.29±13.24)μmol/L比(350.11±10.21)μmol/L,(P<0.05);治疗后观察组病人IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α均明显低于对照组(37.85±3.77)ng/L比(31.29±3.84)ng/L,(57.63±6.11)ng/L比(41.21±3.45)ng/L,(143.29±9.92)ng/L比(103.23±8.54)ng/L,(72.39±2.84)ng/L比(61.29±2.17)ng/L,(P<0.05);治疗后观察组病人miR-22-3p水平明显高于对照组1.13±0.11比0.84±0.12,(P<0.05);治疗后观察组病人血中miR-22-3p与尿酸水平呈显著负相关关系,其相关性模型为Y=-119.58X+488.87,R2=0.9143;痛风性关节炎病人血中miR-22-3p与双醋瑞因联合依托考昔治疗临床疗效呈显著性负相关关系(r=-0.64,P<0.05)。结论 采用双醋瑞因联合依托考昔治疗痛风性关节炎后可有效调控体内miR-22-3p水平,改善病人治疗临床疗效。

LncRNA MIR22HG调节miR-132-3p/TLR2轴对急性心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响

目的:探讨长链非编码RNA miR-22宿主基因(lncRNA MIR22HG)调节miR-132-3p/Toll样受体2(TLR2)轴对急性心肌梗死(AMI)小鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响。方法:取C57BL/6J小鼠随机分为sham组、AMI组、AMI+sh-NC组、AMI+shMIR22HG组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-NC组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-132-3p组,每组10只,除去sham组外,其它组都进行冠状动脉左前降支结扎,sham组只开胸不结扎冠状动脉,其中AMI+sh-NC组、AMI+sh-MIR22HG组、AMI+shMIR22HG+antagomir-NC组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-132-3p组小鼠分别相对应的对尾静脉注射sh-NC、sh-MIR22HG、sh-MIR22HG+antagomir-NC、sh-MIR22HG+antagomir-132-3p。超声心动图评估小鼠心室重构和心脏功能;HE染色和Masson染色观察心肌组织病理学变化及纤维化;RT-qPCR检测心肌组织MIR22HG、miR-132-3p表达;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;Western blotting检测心肌组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleved caspase-3)/半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、collagenⅢ和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;双荧光素酶报告基因实验分别验证MIR22HG和miR-132-3p、miR-132-3p和TLR2的关系。结果:与sham组比较,AMI组小鼠心功能显著降低,心肌组织损伤、心肌纤维化加重,心肌细胞凋亡率、MIR22HG、TLR2、cleved caspase-3/caspase-3、collagenⅠ、collagenⅢ和α-SMA蛋白表达水平显著升高,miR-132-3p和Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与AMI+sh-NC组比较,AMI+sh-MIR22HG组小鼠心功能改善,心肌组织损伤、心肌纤维化减轻,心肌细胞凋亡率、MIR22HG、TLR2、cleved caspase-3/caspase-3、collagenⅠ、collagenⅢ和α-SMA蛋白表达水平显著降低,miR-132-3p和Bcl-2蛋白表达上升(P<0.05);下调miR-132-3p减弱了敲减MIR22HG对心肌组织的保护作用;双荧光素酶报告基因实验结果显示,MIR22HG靶向调控miR-132-3p表达,miR-132-3p靶向负调控TLR2表达。结论:抑制MIR22HG表达可通过调节miR-132-3p/TLR2轴抑制AMI小鼠心肌细胞凋亡,改善小鼠心室重构。

LncRNA NEAT1调控miR-22-3p对脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞生物学活性影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)核富集转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,Neat1)调控微小RNA miR-22-3p对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)生物学活性的影响。方法取对数生长期的HGFs细胞分为对照组、LPS组、si-NC组、si-Neat1组、si-Neat1+inhibitor NC组、si-Neat1+miR-22-3p inhibitor组。RT-qPCR检测Neat1、miR-22-3p表达水平;双荧光素酶验证Neat1、miR-22-3p的靶向关系;流式细胞仪、CCK-8、ELISA法分别检测细胞凋亡、细胞活力及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平;蛋白质印迹检测Caspase-3、磷酸化核转录因子-κB(phosphorylated nuclear factor-κB,p-NF-κB)P65/NF-κB P65水平。结果与对照组比较,LPS组细胞活力、miR-22-3p表达显著降低,TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、p-NF-κB P65/NF-κB P65、Neat1、Caspase-3表达显著增加(P<0.05);与LPS组、si-NC组比较,si-Neat1组细胞活力、miR-22-3p表达显著增加,TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、p-NF-κB P65/NF-κB P65、Neat1、Caspase-3表达显著降低(P<0.05);下调miR-22-3p表达逆转了沉默Neat1对LPS诱导HGFs生物学活性的影响(P<0.05)。结论沉默Neat1可以抑制LPS诱导HGFs的细胞凋亡、炎症反应,可能与上调miR-22-3p表达有关。

miR-192-5p和miR-22-3p在痛风性关节炎患者中的表达水平及调节机制

目的:分析痛风性关节炎患者血清miR-192-5p和miR-22-3p的表达水平及调节机制。方法:将秦皇岛市第一医院2020年1月2021年12月收治65例痛风性关节炎患者和65例健康体检人员分别分为观察组和对照组,采用实时荧光定量PCR法检测患者血清miR-192-5p和miR-22-3p的表达水平及相对表达量,采用红细胞沉降压积仪检测红细胞沉降率(ESR),用全自动生化分析仪检测血尿酸(BUA)。结果:与对照组比较,观察组患者血清miR-192-5p和miR-22-3p相对表达量升高(均P<0.05),ESR和BUA升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10表达水平升高(均P<0.05),Th1细胞表达水平和Th1/Th2比值升高(均P<0.05),Th2细胞表达水平降低(P<0.05)。ROC曲线分析发现,血清miR-192-5p和miR-22-3p在痛风性关节炎中具有良好的诊断效能。结论:痛风性关节炎患者血清miR-192-5p和miR-22-3p异常升高,其可能机制与炎症反应和免疫反应相关。

AKT3逆转miR-22-3p/29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用

目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT3)能否逆转miR-22-3p/29a-3p对人肝星状细胞LX-2活化的协同抑制作用。方法利用TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA预测miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,对筛选出的靶基因进行KEGG、GO和蛋白-蛋白互作(PPI)分析;RNAhybrid分析候选靶基因与两个miRNAs结合的自由能,并通过双萤光素酶报告实验确定它们的靶向关系;采用CCK-8、Transwell和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LX-2细胞增殖、迁移以及纤维化标志物的表达。结果miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因有24个,且它们富集在与肝纤维化相关的信号通路和生物学过程;候选靶基因AKT3与miR-22-3p和miR-29a-3p的结合自由能分析结合双萤光素酶实验结果提示AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因;miR-22-3p和miR-29a-3p mimics能够单独或协同抑制LX-2细胞的增殖、迁移以及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原α1链(COL1A1)mRNA的表达(P<0.05),AKT3过表达后能够逆转miR-22-3p和miR-29a-3p mimics对LX-2细胞的上述协同抑制作用(P<0.05)。结论AKT3过表达可逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用。

lncRNA MALAT1调节miR-22-3p/NLRP3轴对LPS诱导的急性肺损伤的影响

目的探究长链非编码RNA MALAT1通过miR-22-3p/NLRP3信号轴促进脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的分子机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、ALI组、sh-NC组、sh-MALAT1组,每组9只。通过气管内灌注LPS法建立ALI大鼠模型,假手术组气管内灌注等量的PBS作为阴性对照,sh-NC组、sh-MALAT1组在LPS诱导前48 h,通过静脉分别注射2×10^(7) TU/mL的sh-NC慢病毒或相同剂量的sh-MALAT1慢病毒。通过HE染色法观察肺组织的组织病理学改变;通过TUNEL染色法观察肺组织的细胞凋亡情况。通过双荧光素酶报告基因系统验证MALAT1与miR-22-3p、NLRP3与miR-22-3p的调控关系;通过实时荧光定量PCR技术和免疫印记技术检测肺组织和细胞中MALAT1、miR-22-3p、NLRP3、ASC、caspase-1的表达水平;通过酶联免疫吸附试验检测支气管肺泡灌洗液和细胞培养基中白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌情况;通过CCK-8技术检测A549细胞增殖情况;通过流式细胞术检测A549细胞凋亡情况。结果与假手术组相比,LPS诱导的ALI大鼠肺组织和A549细胞中MALAT1、NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA水平显著升高,miR-22-3p水平显著降低(P<0.05)。此外,与假手术组相比,LPS诱导的ALI大鼠肺组织的组织病理损伤水平、炎症反应和细胞凋亡率升高(P<0.05)。与ALI组、sh-NC组相比,抑制MALAT1表达可改善LPS诱导的ALI大鼠肺组织和细胞中的炎症反应和细胞凋亡(P<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,MALAT1与miR-22-3p、NLRP3与miR-22-3p存在相互调控关系。与ALI组、sh-NC组相比,sh-MALAT1组肺组织中MALAT1、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平降低(P<0.05),miR-22-3p水平升高(P<0.05)。同时,BALF上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平降低(P<0.05)。此外,下调MALAT1的同时抑制miR-22-3p表达后,细胞中miR-22-3p和Bcl-2表达水平显著降低,细胞增殖水平亦显著降低(P<0.05)。结论降低MALAT1的表达可通过促进miR-22-3p的表达,从而抑制NLRP3的蛋白水平,并最终抑制LPS诱导的ALI模型中的炎症反应和细胞凋亡。

血清骨生成诱导因子及miR-22-3p表达水平对2型糖尿病肾病早期诊断价值研究

目的分析血清骨生成诱导因子(osteoinductive factor,OIF)和微小核糖核酸(microRNA,miR)-22-3p在2型糖尿病肾病(type 2 diabetes nephropathy,T2DN)早期诊断中的价值。方法选取2018年3月~2020年3月重庆医科大学附属遂宁市中心医院2型糖尿病患者190例为研究对象,根据24h尿微量清蛋白排泄率(24 hour urinary microalbumin excretion rate,24h UAER)分为糖尿病无肾病组(n=58)、早期糖尿病肾病组(n=62)及临床糖尿病肾病组(n=70)。并以同期体检的健康体检者50例为健康对照组。比较各组血清OIF和miR-22-3p水平,Pearson法分析血清OIF,miR-22-3p表达与肾功能指标的相关性。采用受试者工作曲线分析血清OIF和miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病的诊断效能。结果糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组及临床糖尿病肾病组血清OIF(7.81±1.31pg/ml,9.75±1.45 pg/ml,13.44±1.61pg/ml)和miR-22-3p(1.03±0.18,5.43±0.81,7.42±0.95)表达水平均高于健康对照组(6.42±1.22 pg/ml,0.82±0.12),差异有统计学意义(t=5.675~48.790,均P<0.05)。早期糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于糖尿病无肾病组(t=7.673,40.436,均P<0.05),临床糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于早期糖尿病肾病组(t=13.766,12.863,均P<0.05),差异具有统计学意义。糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组和临床糖尿病肾病组血清尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER表达水平依次升高(t=1.847~47.555,均P<0.05),eGFR表达水平依次降低(t=10.018,5.416,P<0.05),差异均有统计学意义。血清OIF和miR-22-3p表达水平与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER呈正相关(r=0.510~0.604,均P<0.01),与eGFR呈负相关(r=-0.476,-0.408,均P<0.01);血清OIF,miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病诊断的曲线下面积(area under the curve,AUC)及95%置信区间(95%confidence intervals,95%CI)分别为0.815(95%CI:0.761~0.859),0.726(95%CI:0.706~0.812)及0.893(95%CI:0.849~0.950)。联合检测血清OIF,miR-22-3p对早期糖尿病肾病的诊断效能高于单一指标(Z=2.305,2.616,P=0.018,0.010)。结论2型糖尿病肾病患者血清OIF和miR-22-3p表达升高,两者与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER及eGFR有关,联合检测有助于2型糖尿病肾病的早期诊断。

miR-22-3p靶向NLRP3表达对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞焦亡的影响

目的:探究miR-22-3p对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠细胞焦亡的作用及其对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)表达的靶向调控机制。方法:选取2019年12月至2020年3月甘肃医学院附属医院收治的45例急性缺血性脑卒中患者(CIRI)作为研究对象,并选同期体检的健康志愿者40例作为对照组,qRT-PCR检测血清miR-22-3p和NLRP3等相关基因表达,并进行相关性分析;双荧光素酶基因报告分析miR-22-3p与NLRP3的关系;线栓法构建CIRI大鼠模型。Sham组大鼠在造模过程中仅暴露不结扎,造模手术前4 h,CIRI+mimic组大鼠侧脑室注射10µl miR-22-3p-mimic,CIRI+mimic+pc大鼠侧脑室注射10µl miR-22-3p-mimic和pcDNA3.1-NLRP3,Sham组和CIRI组大鼠侧脑室注射等剂量miR-22-3p-mimic-NC。TTC染色检测各组大鼠脑梗死面积,尼氏染色检测各组大鼠脑组织神经细胞活性;ELISA检测大鼠血清IL-1β和IL-18含量;免疫组化检测各组大鼠脑组织半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表达;Western blot检测各组大鼠脑组织NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达。结果:与对照组相比,CIRI患者血清miR-22-3p、Akt、JAK1、PI3K、STAT3等基因表达明显下降,NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、ASC等基因表达明显升高(P<0.05)。CIRI患者血清miR-22-3p与NLRP3(r=−0.80,P=0.000)、IL-1β(r=−0.20,P=0.002)、IL-18(r=−0.25,P=0.004)、Caspase-1(r=−0.35,P=0.005)、ASC(r=−0.30,P=0.001)等基因表达呈负相关。miR-22-3p靶向调控NLRP3表达。过表达miR-22-3p明显降低CIRI大鼠脑梗死面积,增强神经细胞活性,下调IL-1β和IL-18含量及Cas-pase-1、NLRP3、ASC表达。而pcDNA3.1-NLRP3能明显逆转这些抑制作用。结论:CIRI中,miR-22-3p能够靶向调控NLPR3表达抑制神经元细胞焦亡,发挥神经保护作用。

bta-miR-1343-3p靶向NEDD8调控牛卵泡颗粒细胞增殖与凋亡机制初探

哺乳动物生殖过程中,颗粒细胞的增殖和凋亡在卵子发生、卵泡发育和卵泡闭锁中至关重要。MicroRNA(miRNA)是一种非编码的内源性小分子RNA,主要在转录水平后调控细胞的各项生理活动。由于miRNAs存在的广泛性和多样性,以及一些miRNA序列的保守性与同源性,提示了miRNA可能承担着许多重要的生物学功能。为探讨bta-miR-1343-3p对牛卵泡颗粒细胞功能的影响及作用机制,研究采用牛卵泡颗粒细胞,利用生物信息学软件miRnada和miRDB进行靶基因bta-miR-1343-3p结合位点的预测,采用双荧光素报告试验,验证了bta-miR-1343-3p与NEDD8的靶标关系,通过利用bta-miR-1343-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitors)构建了卵泡颗粒细胞过表达和抑制模型,采用MTT法检测转染模拟物与抑制物卵泡颗粒细胞的增殖情况,并且检测了相关基因表达量的变化。结果显示,在牛卵泡颗粒细胞中过表达bta-miR-1343-3p可抑制NEDD8基因的表达。检测细胞增殖率结果发现,过表达bta-miR-1343-3p可抑制卵泡颗粒细胞的增殖,并可促进卵泡颗粒细胞的凋亡;过表达bta-miR-1343-3p后细胞周期相关基因CDK1、CDK4表达水平显著降低,而Bax与Fas基因表达量显著升高,表明bta-miR-1343-3p靶向调控NEDD8基因影响牛卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡。