重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径.

荞麦芽菜营养成分分析评价

对甜荞(Fagopyrum esculentum)‘榆荞1号’和苦荞(F.tartaricum)‘榆6-21’籽粒萌发过程中胰蛋白酶抑制剂活性及荞麦芽的营养成分进行分析评价。结果表明:荞麦籽粒氨基酸均衡,但籽粒中含有大量胰蛋白酶抑制剂。萌发10 d后,荞麦芽中胰蛋白酶抑制剂活性消失或仅存痕量。利用氨基酸比值系数法评价显示荞麦芽菜的氨基酸较籽粒更为均衡。芽苗中芦丁含量较籽粒增加4-6倍,芽苗中含有丰富的维生素及有机酸。萌发可提高荞麦的营养保健价值。

Potato Ⅰ型蛋白酶抑制剂rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族,典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区,该区内P1'、P2、P6'与P8'位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息,对rBTI中的P2和P8'位氨基酸进行突变,构建了pExSecI-Bti-P44T和pExSecI-Bti-W53R重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后,测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数,以及它们对HepG2细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用.实验结果显示,rBTI的44和53位分别突变为Thr和Arg后,Ki分别为2.91×10-9mol/L和2.97×10-7mol/L,前者较rBTI(Ki=3.56×10-8 mol/L)降低1个数量级,而后者较rBTI升高1个数量级.功能分析显示,rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作用,但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示,作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂,rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响,但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖,仍能发挥其原有的生物学功能.

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。rBTI的相对分子质量约为11kDa,等电点约为6.2。rBTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比(以BApNA为底物)为1:1.5。rBTI的最适pH值为8.0,在pH3.0～8.0之间有较好的热稳定性,100℃加热120min仍保持70%的胰蛋白酶抑制活性。

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2+-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.

甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂 buckwheattrypsinin-hibitor,BTI ,经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族.为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RT-PCR和3′-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段 GenBank登录号为AY335158 ,并命名为BTI-W1.该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸.由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100%.BTI-W1基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础.

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导肝癌细胞H_(22)凋亡的作用及其机制

为了研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)诱导癌细胞凋亡的作用及其机制,采用细胞培养技术,以肝癌细胞系H22为靶细胞,以不同浓度的rBTI体外处理细胞不同时间后,采用MTT检测、DNA电泳分析、细胞核形态学观察、细胞色素c检测、caspases活性检测等方法测定rBTI在体外诱导肝癌细胞H22凋亡的作用。结果显示rBTI能够在体外特异性地抑制H22细胞的生长,诱导H22细胞凋亡,随着rBTI浓度及作用时间的增加,呈现剂量和时间依赖性效应。经rBTI处理的细胞可导致细胞色素c从线粒体释放到细胞质中,并能增强caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性。结果表明,rBTI能特异性地诱导H22细胞凋亡,其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

重组荞麦rBTI的多克隆抗体制备及鉴定

目的:制备重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的多克隆抗体。方法:通过大肠杆菌原核表达系统制备高纯度的rB-TI蛋白,免疫大白鼠,制备多克隆抗体。用Western blot、间接ELISA及免疫细胞组织化学法检测该抗体的效价和特异性。结果:间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶128000以上;Western blot显示该抗体能与BTI蛋白特异结合;免疫组织化学法检测结果显示rBTI主要存在于EC9706细胞的胞质和细胞核内。结论:所制备的大鼠抗rBTI的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性,为rBTI诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究及进一步揭示荞麦胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系提供重要的基础。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。

BTI基因转染诱导EC9706细胞凋亡及G_1阻滞

为了研究荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)对肿瘤细胞凋亡与细胞周期的影响,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与BTI融合蛋白真核表达质粒.将BTI基因成功克隆至pEGFP-N1中转染食管癌EC9706细胞后,激光共聚焦显微镜镜检显示,BTI-EGFP获得良好表达.表达的融合蛋白大部分分布于细胞核,在细胞质中有少量分布.Western印迹检测可见约27kD和36 kD的特异性条带.流式细胞术分析结果显示,BTI能够诱导EC9706细胞发生凋亡,并使细胞停滞于G0/G1期.

BTI和Nisin复合涂膜液对鲈鱼鱼糜的保鲜效果

以明胶和壳聚糖为基本成分制备乳酸链球菌素(nisin)和荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)的复合涂膜保鲜剂。用此复合保鲜剂对鲈鱼鱼糜进行涂膜处理,以菌落总数、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量、pH值、蒸煮损失率等为检测指标,研究复合液对鲈鱼鱼糜的保鲜效果。结果表明,nisin和BTI联合使用可有效抑制鲈鱼鱼糜4℃贮藏过程中微生物的生长,并显著减缓TVB-N及TBARS的增长速率,降低鱼糜的蒸煮损失率。BTI可以提高nisin对蛋白酶的抗性,增强nisin的稳定性,有利于鱼糜的抗菌保鲜,延长鲈鱼鱼糜的冷藏货架期。

一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性(英文)

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内,是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一.本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂(TBTI-Ⅱ) .SDS-PAGE分析表明,TBTI-Ⅱ的分子量约9·0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的Glu, Asp和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67·6 %的抑制剂活性.动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1·01×10-4mol/L.另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用.这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.

rBTI的制备及其对果蝇寿命的影响

构建含荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)表达质粒pExSecI-BTI的工程菌,在100 L发酵罐中放大发酵,发酵产物经热处理及离子交换层析纯化后,获得rBTI产品,其纯度达到95%以上。用含不同质量浓度rBTI(0、20、50μg/mL)的培养基饲养果蝇,并分别检测果蝇的最高寿命,平均寿命和半数死亡时间等。初步研究rBTI对果蝇寿命的影响。结果显示,rBTI能够显著延长果蝇的寿命。在实验剂量范围内,果蝇的寿命与rBTI质量浓度呈现正相关。抗氧化酶活性检测发现,实验组果蝇体内的SOD和CAT活性均显著升高。rBTI延缓果蝇衰老的作用可能是通过刺激机体的氧化应激能力来实现的。

荞麦生物活性物质及其功能研究进展

概述了荞麦生物活性成分如荞麦类黄酮、荞麦蛋白质、胰蛋白酶抑制剂及抗性淀粉的研究现状、存在问题以及发展方向。

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。

rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡

rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况.结果表明,rBTI（2.5μmol/L）与紫杉醇（0.05~0.5μmol/L）联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖.将rBTI与紫杉醇进行联合协同用药,诱导了MCF-7细胞凋亡及ROS的产生;同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核转位;与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和CyclinD1的表达.本研究证实,rBTI联合紫杉醇通过诱导ROS的产生,激活NFκB/p65信号转导途径,协同促进MCF-7细胞的凋亡.

荞麦抗感染多肽研究进展

近年来,国内外学者在荞麦种子内发现了很多抗菌肽、抗肿瘤多肽以及胰蛋白酶抑制剂等抗感染多肽,这些多肽的结构特征和实际应用的研究越来越受关注。主要综述了荞麦抗感染多肽的分子结构特征,抗菌、抗肿瘤、胰酶抑制等生理活性及其作用信号机制等方面的研究进展。

rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN)是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(r BTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p-PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用q RT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p-PTEN在r BTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,r BTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;r BTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,r BTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。

截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS-PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98%以上.理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性.将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右.这些结果提示,rBTI的C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能.