毛囊bulge细胞在角膜缘基质诱导下向角膜上皮细胞分化的初步研究

目的探讨体外培养的毛囊bulge细胞向角膜上皮细胞分化的可能性。方法体外分离培养毛囊bulge细胞,然后在transwell中与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,观察毛囊bulge细胞的分化情况,免疫组化检测K12及K19表达的变化。结果体外培养的毛囊bulge细胞保持高增殖,低分化状态。经过2周左右的共培养,毛囊bulge细胞逐渐分化,部分细胞K12表达阳性。结论角膜缘基质细胞可以诱导毛囊bulge细胞向角膜上皮细胞分化。

PPARγ2表达促毛囊bulge细胞向皮脂腺定向分化的研究

目的探讨毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞分化的机制。方法构建携带过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(peroxisomeproliferatoractivationreceptorγ2,PPARγ2)基因的绿色荧光蛋白(GFAP)质粒,通过质脂体转染到体外分离培养毛囊bulge细胞中,以转染空质粒的毛囊bulge细胞为对照,观察细胞的分化情况,运用免疫细胞化学检测细胞PPARγ和上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)的表达,油红O染色观察细胞脂滴合成情况。结果荧光显微镜下观察到已转染质粒的细胞呈现绿色荧光,能稳定表达PPARγ2mRNA,该细胞分化3周左右,部分细胞胞浆内出现脂滴,PPARγ、EMA及油红O染色阳性,而对照组为阴性,细胞内未见脂滴。结论毛囊bulge细胞可以分化为皮脂腺细胞,PPARγ2基因在其中起着重要作用。

毛囊Bulge细胞的分离培养及生物学特性研究

目的分离培养大鼠毛囊Bulge细胞并观察其生物学特性。方法运用显微分离法及酶消化法分离大鼠毛囊Bulge细胞并进行培养,观察其增殖能力及细胞形态等的改变;采用免疫组化方法,检测毛囊Bulge细胞K19、β1整合素的表达情况。结果本方法培养的大鼠毛囊Bulge细胞纯度高、活力好,具有高增殖、低分化特性,同时表达K19、β1整合素。结论成功地分离培养了毛囊Bulge细胞,并在体外长期保持其低分化特性,为进一步深入研究毛囊发育分化提供了实验基础。

体外培养条件下毛囊bulge细胞分泌的β神经生长因子的检测

目的定性定量地检测毛囊bu lge细胞体外培养条件下分泌的β-神经生长因子(-βnerve growth factor,β-NGF)及其与bu lge细胞生长状态的关系。方法首先使用显微操作技术剥离出原代组织,然后培养原代细胞,使用超薄切片和透射电镜技术来观察原代细胞超微结构,使用酶联免疫吸附(enzym e linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定原代bu lge细胞分泌的β-NGF,利用免疫细胞化学(immunocytochem istry,ICC)方法检测原代细胞中β-NGF的表达。结果成功培养出原代bu lge细胞,ICC方法检测到原代培养的bu lge细胞质表达强阳性β-NGF。超薄切片和透射电镜技术能够显示出原代培养bu lge细胞的内部结构,即核质比大,细胞器较少。通过ELISA方法能够测定出原代细胞分泌的β-NGF与体外原代培养的bu lge细胞特性呈规律性变化。结论原代bu lge细胞分泌的β-NGF呈规律性表达,即生长高峰时期表达最为丰富,这与毛囊bu lge细胞的生长状态具有规律性变化有关,因此他们具有必然的联系。

毛囊bulge干细胞培养方法的比较研究

目的通过对限定性角质形成细胞无血清培养基(DK-SFM)和3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的比较,寻求既能方便获得大量毛囊bulge干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。方法采用DK-SFM和3T3滋养层分别培养毛囊bulge干细胞,通过倒置显微镜观察毛囊bulge干细胞的形态,免疫荧光染色检测毛囊bulge干细胞的特异性标记细胞角蛋白19(CK19)和分化相关抗体群34(CD34)的表达鉴定毛囊bulge干细胞。通过比较2种方法培养的毛囊bulge干细胞的克隆形成率和CD34阳性率的差异,分别比较毛囊bulge干细胞的增殖能力和干细胞的数量,综合评估2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得毛囊bulge干细胞均为铺路石状。免疫荧光染色检测2种培养方法培养的毛囊bulge干细胞CK19和CD34均呈阳性。DK-SFM和3T3滋养层培养的毛囊bulge干细胞克隆形成率分别为69.4%和62.2%。流式细胞仪检测DK-SFM培养的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为72.3%;3T3滋养层培养的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为34.7%。结论DK-SFM和3T3滋养层培养作为毛囊bulge干细胞的2种培养方法,均可以获得未分化的毛囊bulge干细胞。用3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的方法比较复杂,且所获的细胞混杂有3T3细胞,但用此种方法可获得大量的毛囊bulge干细胞。用DK-SFM培养毛囊bulge干细胞方法简单,但细胞不易贴壁,且数量较少,但能有效分离出较纯的毛囊bulge干细胞,保持较好的细胞活性。

无血清K-SFM培养条件下大鼠毛囊Bu lge细胞生物学特性的研究

目的研究无血清K-SFM培养条件下,大鼠毛囊Bu lge细胞的生物学特性。方法分离大鼠毛囊Bu lge细胞,分别置于无血清的K-SFM培养基(实验组)及有血清DMEM/F12培养基(对照组)的培养条件下培养。比较Bu lge细胞在两种培养体系中的生长增殖和K19的表达状况。结果无血清培养的Bu lge细胞在克隆形成率及K19的表达率均明显高于对照组(P<0.05)。结论体外培养和扩增大鼠毛囊Bu lge细胞,无血清的K-SFM培养基较有血清DMEM/F12培养基更有利于Bu lge细胞的扩增和表型的维持。

毛囊上皮细胞对Hedgehog信号的响应与短期毛发再生无关

背景:Hedgehog信号通路对于多种组织的发育、动态平衡以及修复起了重要的作用,前人的研究强调了Hedgehog信号对于毛发模式形成是至关重要的。目的:探究Hedgehog信号在成年后的毛囊上皮动态平衡中发挥的作用。方法:Lgr5-EGFP-Ires-Cre ERT2小鼠、Smofl/fl小鼠与K14-CreER小鼠均来自TheJacksonLaboratory,实验经上海交通大学实验动物伦理与使用委员会批准,批准号为1602028。①首先利用Lgr5-EGFP-Ires-Cre ERT2小鼠特异地标记Lgr5+细胞亚群,确认了在Lgr5+毛囊上皮干细胞/前体细胞中多个Hedgehog信号通路成员高度富集表达。而后用Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2小鼠与Smofl/fl小鼠交配得到了Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2;Smofl/fl小鼠;在刚进入第二轮长静息期的P49天进行背部剃毛,接着用他莫昔芬诱导Hedgehog信号通路的介导蛋白Smo敲除,观察在Lgr5+细胞中敲除Smo对毛发再生速度的影响;之后实验在P50-54天他莫昔芬诱导Smo敲除后1周进行脱毛,进一步评估bulge上皮干细胞在突变小鼠的功能是否有变化;②用K14-Cre ER小鼠与Smofl/fl小鼠交配以得到K14-CreER;Smofl/fl小鼠,同上实验方法,在毛囊整个上皮细胞这一更大范围内用他莫昔芬诱导敲除Smo,观察是否有毛发再生障碍及毛囊Bulge干细胞功能障碍。结果与结论:Lgr5-EGFP-Ires-Cre ERT2;Smofl/fl小鼠模型及K14-CreER;Smofl/fl小鼠模型中均没有观测到明显的毛发再生障碍,毛囊Bulge干细胞也没有受到影响。说明Lgr5+细胞群和整个毛囊上皮对于Hedgehog信号通路的响应与毛囊静息期向生长期转换以及短期的毛发再生无关,且与bulge上皮干细胞的维持也无关。这一发现强调了组织发育和动态平衡之间的不同分子机制,为人们更加准确地理解毛囊再生和组织生长的机制提供了重要依据。