傣药咪多领通过Wnt/β-catenin/c-myc信号通路对增生性瘢痕表皮干细胞干性的作用机制

目的探讨傣药咪多领(云南琵琶甲)通过Wnt/β-catenin/c-myc信号通路对增生性瘢痕表皮干细胞干性的影响。方法构建增生性瘢痕动物模型,分为NC组、Model组、PC组、LD组、MD组和HD组。分离并鉴定Model组中表皮干细胞,分为control组、LD-cell组、MD-cell组和HD-cell组。HE染色观察各组增生性瘢痕组织;Western blot、RT-qPCR及免疫荧光检测Integrinβ1、p63、Wnt、β-catenin和c-myc的表达水平;CCK-8检测各组表皮干细胞增殖活力;干细胞成球实验检测各组表皮干细胞成球效率。结果体内实验发现,傣药咪多领可显著下调增生性瘢痕的瘢痕增生指数(hypertrophic indx,HI)(P<0.05),且减少增生性瘢痕中成纤维细胞数量和胶原密度。体内和体外实验均发现,Integrinβ1、p63、Wnt、β-catenin和c-myc在增生性瘢痕组织和表皮干细胞中异常高表达,且傣药咪多领能恢复它们的表达水平(P<0.05)。进一步发现,傣药咪多领能够抑制Wnt/β-catenin/c-myc通路激活剂LiC1的作用,进而下调表皮干细胞增殖活力和成球效率(P<0.05)。结论傣药咪多领通过抑制Wnt/β-catenin/c-myc信号通路激活,从而抑制表皮干细胞干性,进而对增生性瘢痕具有良好的治疗效果。

高表达MYH9通过激活AKT/c-Myc通路抑制非小细胞肺癌细胞凋亡

目的探讨肌球蛋白重链9(MYH9)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡和对顺铂敏感性的影响并探讨其作用机制。方法常规培养6株NSCLC细胞系(A549、H1299、H1975、SPCA1、H322、H460)和1株正常支气管上皮细胞系(16HBE)采用Westernblot法检测MYH9的表达情况;采用免疫组织化学染色法检测NSCLC患者组织MYH9的表达,实验分为癌组织(49例)和癌旁组织(43例);常规培养H1299和H1975细胞系,使用CRISPR/Cas9技术构建MYH9敲除的NSCLC细胞系,实验分为sgNC组,sgMYH9组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验检测敲除MYH9对肺癌细胞增殖的影响;Westernblot实验、细胞凋亡流式细胞术检测MYH9对细胞凋亡的影响;通过IC50法检测敲除MYH9的肺癌细胞对顺铂敏感性的影响,实验分为sgNC组、sgMYH9组;培育小鼠肿瘤异种移植物模型验证MYH9体内生物学功能,实验分为sgNC组、sgMYH9组。结果与癌旁组织相比,MYH9在癌组织中上调(P<0.001),高表达患者具有更短的生存(P=0.023)。敲除MYH9抑制细胞增殖(P<0.001),促进细胞凋亡(P<0.05),增加对顺铂的化学敏感性。此外,MYH9的耗竭显著抑制了体内肿瘤生长(P<0.001)。分子机制表明,敲除MYH9使AKT/c-Myc轴失活(P<0.05),从而抑制BCL-2样蛋白1的表达(P<0.05),促进BH3相互作用结构域死亡激动蛋白和凋亡调节剂BAX的表达(P<0.05),并激活胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9(P<0.05)。结论MYH9通过AKT/c-Myc轴调节细胞凋亡,从而促进NSCLC进展。

罗哌卡因经原癌基因信号通路抑制胃癌细胞增殖和迁移的机制

目的探讨罗哌卡因经原癌基因(c-MYC)信号通路抑制胃癌细胞增殖和迁移的机制。方法体外培养人胃癌MGC-803细胞进行实验,分为对照组、罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因中剂量组、罗哌卡因高剂量组和顺铂组。罗哌卡因低、中、高剂量组分别给予终浓度为100、200、400μg/mL的罗哌卡因;顺铂组给予终浓度为10 mmol/mL的顺铂;对照组无处理。继续培养24 h后,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖率,细胞划痕法检测MGC-803细胞迁移能力,同时检测MGC-803细胞中蛋白激酶C(PKC)、c-MYC、金属蛋白酶-9(MMP-9)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达。结果罗哌卡因低、中、高剂量组和顺铂组的MGC-803细胞增殖率[(92.05±8.24)%、(76.26±6.93)%、(53.18±5.86)%、(42.18±15.17)%]和迁移能力[(36.34±4.03)μm、(31.21±3.56)μm、(24.60±2.57)μm、(18.07±1.26)μm]较对照组[(100.00±5.91)%、(40.12±5.17)μm]明显降低(P<0.05);上述各组MGC-803细胞中PKC[(0.62±0.06)、(0.50±0.08)、(0.42±0.08)、(0.36±0.10)]、c-MYC[(0.53±0.09)、(0.49±0.15)、(0.43±0.02)、(0.31±0.04)]、MMP-9[(0.47±0.03)、(0.42±0.05)、(0.30±0.04)、(0.21±0.06)]、PI3K[(0.39±0.04)、(0.33±0.08)、(0.28±0.04)、(0.25±0.01)]、AKT[(0.50±0.10)、(0.43±0.09)、(0.24±0.02)、(0.16±0.03)]和mTOR[(0.42±0.05)、(0.36±0.03)、(0.30±0.02)、(0.25±0.04)]表达较对照组[(0.74±0.08)、(0.63±0.06)、(0.53±0.05)、(0.46±0.07)、(0.71±0.04)、(0.49±0.06)]明显降低(P<0.05),且各罗哌卡因剂量组降低强度呈剂量依赖性,但各指标均仍高于顺铂组(P<0.05)。结论罗哌卡因可抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移,其机制可能与抑制c-MYC信号通路的激活有关。

微小RNA-6768-5p在肺癌组织中的表达及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨miR-6768-5p在肺癌组织中的表达及通过靶向调控羧肽酶A4(CPA4)对肺癌细胞增殖及侵袭的影响。方法 使用TCGA数据库分析肺癌组织和癌旁组织中miR-6768-5p的表达,使用实时定量PCR(qPCR)检测人肺癌细胞系(HCC1588、H1650、H1299、A549、HCC827)和正常肺泡上皮细胞(HPAEpiC细胞)中miR-6768-5p的表达。分别转染NC mimics、miR-6768-5p mimics至肺癌细胞,分别作为NC组和miR-6768-5p组。使用MTS实验、Matrigel侵袭实验分别检测各组细胞增殖和侵袭能力。使用RNAhybrid软件和双荧光素酶报告基因实验验证miR-6768-5p和CPA4的假定结合位点。qPCR检测各组细胞中CPA4 mRNA的表达。通过Western blot分析各组细胞中AKT/c-MYC信号通路蛋白的表达情况。结果 与癌旁组织比较,miR-6768-5p相对表达水平在肺癌组织中明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与HPAEpiC细胞比较,miR-6768-5p相对表达水平在肺癌细胞系中明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,miR-6768-5p组细胞增殖率明显降低(P<0.05)。NC组和miR-6768-5p组侵袭细胞数分别为(131.30±12.55)个和(37.45±7.77)个,miR-6768-5p组侵袭细胞数明显低于NC组(P<0.05)。miR-6768-5p组H1299细胞内CPA4 mRNA相对表达水平明显低于NC组(t=4.93,P<0.05)。与NC组比较,miR-6768-5p组AKT/c-MYC信号通路蛋白p-AKT、p-mTORC1、XIAP、MDM2、c-MYC蛋白表达明显降低。结论 肺癌组织中miR-6768-5p表达降低,miR-6768-5p可能通过靶向CPA4,抑制AKT/c-MYC信号通路激活,降低肺癌H1299细胞的增殖和侵袭能力。

高迁移率族蛋白B1促进结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制探讨

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在结肠癌细胞中的表达和对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用qPCR与Western blot法检测人结肠癌SW620细胞与正常结肠上皮细胞FHC中HMGB1的mRNA和蛋白表达。通过Lipofectamine 3000转染质粒构建稳定下调HMGB1表达(shHMGB1)的SW620细胞,同时设置阴性对照(shNC)细胞和空白对照(blank)细胞;采用CCK-8、平板集落形成实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移及侵袭能力。采用Western blot检测HMGB1表达下调对p-ERK、ERK、c-Myc、基质金属蛋白酶(MMP)-2/9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Bcl-2及Bax的蛋白表达水平的影响。结果:SW620细胞中HMGB1在mRNA及蛋白水平表达均高于正常结肠上皮细胞FHC(P<0.05)。经qPCR与Western blot验证,HMGB1低表达细胞构建成功。与blank组和shNC组相比,shHMGB1组细胞增殖、迁移和侵袭能力受到显著抑制(P<0.01)。Western blot结果表明,同blank组和shNC组比较,shHMGB1组细胞的MMP-2、MMP-9、N-cadherin、c-Myc、Bcl-2及ERK磷酸化蛋白表达显著下调,Bax蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论:HMGB1可促进结肠癌SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力,ERK/c-Myc信号通路参与了这一过程。

GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响及作用机制探讨

目的通过检测G蛋白偶联受体家族C群5成员A(G protein coupled receptor C type group 5 member A,GPRC5A)在肝癌组织及细胞中的表达,探讨GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响及其相关作用机制。方法收集2018年12月~2019年11月在解放军联勤保障部队第九六九医院行手术治疗的38例肝癌患者癌组织及配对癌旁正常组织样本;另选取人正常肝上皮细胞株HL-7702和人肝癌细胞株(HepG2,HCCLM3,HuH-7和MHCC-97H)进行研究。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌组织、癌旁正常组织及肝癌细胞、正常肝上皮细胞中GPRC5A表达量。通过转染pcDNA3.1-GPRC5A质粒构建过表达GPRC5A肝癌细胞株,采用MTT实验和V-FITC/PI凋亡试剂盒分别检测过表达GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。采用活性氧指示剂DCFH-DA检测细胞中氧化应激相关因子活性氧(ROS),NAD+/NADH和三磷酸腺苷(ATP)水平。采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白caspase-3及上皮生长因子(VEGF)蛋白表达水平。结果肝癌组织中GPRC5A表达较癌旁正常组织显著降低(0.34±0.09 vs 0.73±0.10),差异有统计学意义(t=17.869,P<0.01)。肝癌细胞HepG2(0.35±0.06),HCCLM3(0.38±0.10),HuH-7(0.53±0.07),MHCC-97H(0.67±0.06)中GPRC5A表达量显著低于人正常肝上皮细胞HL-7702中的GPRC5A表达量(1.00±0.08),差异有统计学意义(t=5.716~11.258,均P<0.05)。pcDNA3.1-GPRC5A组转染36 h细胞增殖吸光度(A)值(0.94±0.16)显著低于对照组(1.49±0.05)和pcDNA3.1组(1.45±0.07)(F=25.640,P<0.01)。GPRC5A过表达组VEGF(0.98±0.04)表达量较对照组(2.94±0.15)和pcDNA3.1组(2.89±0.11)显著降低(F=310.450,P<0.001)。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中ROS(182.12±13.42)水平显著高于对照组(101.23±11.20)和pcDNA3.1组(98.30±10.26)(F=49.577,P<0.001);NAD+/NADH(35.24±6.43)及ATP(55.34±6.51)水平显著低于对照组(100.25±12.41,100.17±14.36)和pcDNA3.1组(97.86±9.67,102.23±11.02)(F=42.338,17.077,P<0.05)。GPRC5A过表达组细胞凋亡率高于对照组和pcDNA3.1组;细胞凋亡蛋白caspase-3(2.61±0.16)表达量也高于对照组(1.00±0.11)和pcDNA3.1组(1.01±0.02)(F=202.843,P<0.001)。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中p-STAT3表达量(0.43±0.06)显著低于对照组(1.00±0.13)和pcDNA3.1组(1.03±0.12)(F=29.476,P<0.001);pcDNA3.1-GPRC5A组下游基因Socs3(0.47±0.05),c-MYC(0.54±0.06)表达量也显著低于对照组(1.01±0.05,1.00±0.04)和pcDNA3.1组(0.98±0.09,1.02±0.06)(F=63.275,75.409,P<0.001)。肝癌组织中STAT3与GPRC5A表达量呈显著负相关(r=-0.746,P<0.01)。过转染pcDNA3.1-STAT3或pcDNA3.1-NLRP3后显著逆转了pcDNA3.1-GPRC5A对肝癌细胞的抑制作用(P<0.05)。结论GPRC5A低表达可能通过调节STAT3/Socs3/c-MYC信号和炎症反应抑制了肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞的氧化应激和凋亡。

FBXW7在食管癌组织中的表达及其对细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察FBXW7在食管癌组织中的表达及其对食管癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,探究其分子机制。方法应用实时定量PCR和Western blot法检测在西安交通大学第一附属医院普外科收集的40例食管癌组织和40例癌旁正常组织样本中FBXW7的表达水平。利用癌症基因组图谱(the cancer genome altas,TCGA)与基因型-组织表达工程(the genotype-tissue expression project,GTEX)数据库分析FBXW7在食管癌组织和正常食管组织(食管-黏膜和食管-肌层)中的表达情况。TE-1细胞和EC9706细胞分别分为3组:阴性对照组、siRNA-1组和siRNA-2组,分别转染NC-siRNA、FBXW7 siRNA-1和FBXW7 siRNA-2。采用实时定量PCR和Western blot法分别检测食管癌细胞TE-1和EC9706中siRNAs对FBXW7的沉默效率。应用MTT比色法分析转染FBXW7 siRNAs对TE-1和EC9706细胞增殖活力的影响;采用流式细胞仪分析转染FBXW7 siRNAs对TE-1和EC9706细胞周期和细胞凋亡的影响。应用Western blot分析转染FBXW7 siRNAs对TE-1和EC9706细胞中c-Myc和Cyclin D1蛋白表达的影响。结果与癌旁组织相比,FBXW7在食管癌组织中表达显著下调(P<0.01)。TCGA和GTEX数据库分析显示,与癌旁正常组织相比,FBXW7在食管癌组织中显著低表达(P<0.05)。与阴性对照组相比,FBXW7 siRNA-1组和siRNA-2组TE-1和EC9706细胞中FBXW7 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01),细胞活力显著增加(P<0.01)。与阴性对照组相比,FBXW7 siRNA-1组和siRNA-2组TE-1和EC9706细胞中G1/G0期细胞比例显著减少(P<0.01),S期与G2/M期细胞比例显著增加(P<0.01);与阴性对照组相比,FBXW7 siRNA-1组和siRNA-2组早期凋亡和晚期凋亡数量显著减少(P<0.05)。与阴性对照组相比,FBXW7 siRNA-1组和siRNA-2组TE-1和EC9706细胞中c-Myc信号通路相关蛋白c-Myc和Cyclin D1表达增加(P<0.01)。结论FBXW7在食管癌组织中低表达,可能通过激活c-Myc信号通路促进食管癌细胞增殖、周期转换,抑制细胞凋亡。

尿素循环限速酶CPS1对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的探讨尿素循环限速酶CPS1影响肝癌细胞增殖及凋亡的可能机制。方法用慢病毒分别构建CPS1高表达(Hepa1-6-CPS1)和低表达(Huh7-shCPS1)的稳转肝癌细胞系;细胞生长实验和克隆形成实验评价CPS1对肝癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;小鼠皮下移植瘤模型验证CPS1对肝癌生长的影响,免疫组织化学法检测皮下瘤组织中Ki-67及CPS1含量;Western blotting检测肝癌细胞中CPS1及c-Myc的表达量。结果与正常肝细胞相比,CPS1在肝癌细胞中的表达均有所下调(P<0.05);与阴性对照组比较,CPS1在Hepa1-6-CPS1和Huh7-shCPS1细胞中的表达量分别显著上调和下调(P均<0.05);细胞生长实验及克隆形成实验结果显示,CPS1低表达或高表达分别促进或抑制肝癌细胞生长(P<0.05),增加或减少其克隆形成数(P<0.001);流式细胞术检测结果显示,CPS1低表达的肝癌细胞凋亡能力被抑制(P<0.001),而CPS1高表达则促进肝癌细胞凋亡(P<0.05);与阴性对照组比较,CPS1高表达的皮下移植瘤生长减慢,皮下瘤组织中CPS1表达量与Ki-67呈负相关(P<0.05);Western blotting检测结果显示,CPS1低表达促进c-Myc表达上调(P<0.001),而CPS1高表达则抑制c-Myc表达(P<0.001)。结论尿素循环限速酶CPS1通过调控c-Myc信号通路抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。

α-常春藤皂苷调控SNX10介导的谷氨酰胺代谢抑制肠上皮细胞恶性转化研究

目的 研究干扰分选连接蛋白10(sorting nexin 10,SNX10)表达对人正常肠上皮FHC、NCM460细胞增殖、谷氨酰胺代谢的影响及α-常春藤皂苷调控作用的分子机制。方法 利用转染技术构建稳定敲低SNX10的FHC、NCM460细胞,qRT-PCR和Western blotting检测敲低效率;CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖能力;MTT筛选α-常春藤皂苷实验浓度并检测其对SNX10表达的影响;检测细胞内还原型谷胱甘肽含量;Western blotting检测细胞SNX10、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1)/c-myc信号通路相关蛋白及下游谷氨酰胺转运蛋白SLC7A5表达情况。结果 敲低SNX10后FHC、NCM460细胞增殖异常加快(P<0.01),细胞内还原型谷胱甘肽含量异常升高(P<0.01),m TORC1/c-myc通路被激活,下游SLC7A5表达升高;而α-常春藤皂苷干预SNX10敲低细胞系后,细胞SNX10表达升高(P<0.05、0.01),且上述变化发生逆转并渐趋空载细胞水平。结论 SNX10有望成为结直肠癌临床诊断及防治的新靶点,α-常春藤皂苷可逆转肠上皮细胞因SNX10敲低导致的快速增殖、m TORC1/c-myc信号通路活化及谷氨酰胺代谢的异常升高,从而抑制正常肠上皮细胞的恶性转化。

人参皂苷Rh_(2)抑制人非小细胞肺癌细胞增殖的机制研究

目的考察人参皂苷Rh_(2)对人非小细胞肺癌A549及H460细胞增殖的影响,并进一步探讨其作用机制。方法人参皂苷Rh_(2)处理A549及H460细胞,采用CCK-8法及克隆形成实验检测药物对细胞增殖的作用;观察药物对细胞形态的影响,利用Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡情况;利用乳酸检测试剂盒检测药物对细胞糖酵解产物即乳酸生成的影响;采用Western blotting法检测药物对线粒体凋亡蛋白[B淋巴细胞瘤2 (B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)],糖酵解调节通路信号传导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/c-myc及糖酵解途径关键酶丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2,PKM2)、乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase A,LDHA)表达的影响。上调c-myc表达后,观察人参皂苷Rh;对A549及H460细胞乳酸水平的影响。结果人参皂苷Rh;可明显抑制A549及H460细胞的增殖能力及克隆形成能力(P<0.05、0.01、0.001),呈剂量和时间相关性。人参皂苷Rh;明显改变A549及H460细胞形态并诱导细胞凋亡(P<0.05),显著降低乳酸生成量(P<0.05、0.01)。人参皂苷Rh;可显著下调Bcl-2/Bax、PKM2、LDHA蛋白表达水平(P<0.05、0.01),上调Caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),并抑制STAT3/c-myc通路活性(P<0.05、0.01)。上调c-myc表达后,人参皂苷Rh_(2)对A549及H460细胞乳酸水平的抑制作用减弱(P<0.05、0.01)。结论人参皂苷Rh_(2)显著抑制A549及H460细胞的增殖,其机制可能是通过调控线粒体凋亡蛋白、抑制STAT3/c-myc通路及糖酵解关键酶的表达干扰糖酵解,最终导致细胞凋亡。

雷公藤红素对非小细胞肺癌细胞增殖及迁移的影响

目的探讨雷公藤红素对非小细胞肺癌细胞NCI-H460增殖及迁移的影响及可能分子机制。方法将不同浓度的雷公藤红素作用于非小细胞肺癌NCI-H460细胞,通过CCK-8检测细胞的增殖情况;划痕实验检测细胞迁移情况;Western blot检测MMP2、MMP9及LEF1/c-myc的蛋白表达。结果1 mg/L的雷公藤红素开始对NCI-H460细胞有增殖抑制作用,而浓度越高对NCI-H460细胞的增殖抑制越强;雷公藤红素作用后,NCI-H460细胞迁移能力降低、NCI-H460细胞MMP2和MMP9蛋白的表达降低,LEF1/c-myc信号通路被抑制。结论雷公藤红素可能通过抑制LEF1/c-myc信号通路调节MMP2和MMP9蛋白表达,抑制NCI-H460细胞的增殖和迁移。