TpbA通过调节c-di-GMP抑制鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成

目的分析生物膜形成相关的酪氨酸磷酸酶A(TpbA)经调节3,5-环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)影响鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成。方法通过上海生工合成TpbA基因序列,构建pET-28a-TpbA载体,原核重组表达目的蛋白TpbA经亲和层析纯化后并用western blot验证,将该载体转入鲍曼不动杆菌ATCC17978,采用western blot和磷酸酶活性实验鉴定TpbA表达及活性,分析c-di-GMP表达水平及生物膜形成情况。结果在成功构建pET-28a-TpbA载体并证实表达TpbA的基础上,将该载体转入鲍曼不动杆菌ATCC17978,western blot表明TpbA过表达(P<0.05),磷酸酶活性实验证实过表达的TpbA具有酶活性(P<0.05)。进一步分析发现,ATCC17978中TpbA过表达能够降低c-di-GMP的水平(P<0.05),表明TpbA能够有效调节鲍曼不动杆菌的c-di-GMP。ATCC17978中c-di-GMP相关的生物膜形成在TpbA过表达作用下能够被显著抑制(P<0.05)。结论本研究初步证实了TpbA通过调节c-di-GMP,可以抑制ATCC17978生物膜形成,为抑制鲍曼不动杆菌生物膜的形成提供了新的潜在靶点和实验数据。

病原细菌受体介导的c-di-GMP信号传导及其调控机制

细菌第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号网络系统主要涉及信号代谢、识别、接受、传递、功能表达和调控。c-di-GMP胞内水平受到鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)的控制。c-di-GMP信号受体类型多样,包括转录调控因子、PilZ结构域蛋白、退化的GGDEF和EAL结构域蛋白、核糖体开关、多核苷酸磷酸化酶和新发现的蛋白激酶等。c-di-GMP受体接受信号后,可以在转录、翻译以及翻译后水平上对下游靶标进行调控,从而影响细菌的毒性、运动性、生物膜形成、细胞分裂等生理生化过程。本文结合本实验室对水稻白叶枯病菌的研究结果,综述了近年来国内外在c-di-GMP信号受体介导的调控机制等方面的研究进展。

外源性C-di-GMP对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响

目的:初步探讨外源性c-di-GMP对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响。方法:外源性c-di-GMP与生理盐水分别加入至含变形链球菌UA159菌液的BHI培养基中,比较两组对变形链球菌产酸、耐酸能力的影响。结果:c-di-GMP处理组与生理盐水组相比,产酸、耐酸能力明显下降,差异有统计学意义,经t检验,P<0.05。结论:c-di-GMP可以抑制变形链球菌的产酸、耐酸能力,可以单独也可以与其它的抗龋制剂联合应用控制龋病。

环二鸟苷酸(c-di-GMP)作为潜在免疫佐剂的研究进展

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,近年来研究发现环二鸟苷酸作为免疫调节剂作用于真核细胞可产生良好的免疫调节作用,实验研究表明其有可能成为具有潜力的疫苗佐剂。本文综述了c-di-GMP的结构,生物学功能、免疫特性和作为疫苗佐剂研究等方面的最新研究进展。

水稻白叶枯病菌第二信使c-di-GMP代谢酶基因的预测和分析

旨在从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中鉴定出含有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDE)编码基因。预测分析了Xoo已测序菌株中的GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的种类、数量及其序列特征,鉴别了基序保守的DGC或PDE、基序退化的信号受体以及信号输入结构域,验证了部分不同类型结构域蛋白作为DGC/PDE、信号受体以及在细菌毒性调控等方面的功能。

美罗培南对胞内不同c-di-GMP浓度表型铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的:探究美罗培南对胞内不同环二鸟苷酸(c-di-GMP)浓度表型铜绿假单胞菌(PA)生物被膜形成的影响。方法:两倍稀释法测定美罗培南对各菌株的抑菌浓度(MIC);设阴性对照组和3个美罗培南干预组(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)。用1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的美罗培南分别干预野生株PAO1、PA胞内c-di-GMP高表达株(PAO1ΔwspF)、PA胞内c-di-GMP低表达株(PAO1/Plac-yhjH),观察美罗培南对其运动能力的影响,用结晶紫染色法测定美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH菌株的生物被膜形成以及对生物被膜清除能力的影响。结果:在美罗培南的干预下,PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的运动区域直径均比阴性对照组小(P<0.05),所形成的的生物被膜也均比阴性对照组少(P<0. 05),而破坏的生物被膜均比阴性对照组多(P<0. 05)。结论:美罗培南能抑制PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的运动能力以及生物被膜形成,美罗培南能破坏PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH形成的生物被膜,美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF、PAO1/Plac-yhjH的抑制效果不同。

水稻白叶枯病菌c-di-GMP受体Clpxoo关键结合功能位点的确定

旨在确定水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)c-di-GMP信号受体Clpxoo的关键功能位点。通过对Clpxoo蛋白氨基酸位点基因突变,表达载体构建、蛋白诱导表达及其Ni-NTA Resin亲和层析,进行了Clpxoo及其点突变蛋白的原核表达和产物纯化;通过等温滴定量热法(ITC),检测了Clpxoo及其点突变蛋白与c-di-GMP的结合作用。利用基因定点突变和桥接PCR方法,在优化的诱导表达和纯化条件下,成功地获得了Clpxoo点突变蛋白和与c-di-GMP不发生结合的Clpxoo点突变体。结果表明,Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸是与c-di-GMP结合的关键功能位点。

基于RNA适配体检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP

旨在建立简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7启动子、VC2GEMM-1核糖开关序列或其突变序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的双链DNA为模板,利用T7RNA聚合酶体外转录体系制备VC2、VC2/g20aRNA适配体。通过检测绿色荧光强度分析RNA适配体对c-di-GMP和cGAMP的结合能力。结果表明,转录得到的RNA经过加热变性、缓慢退火后得到VC2RNA适配体和VC2/g20a RNA适配体,在125mmol·L^(-1 )KCl和30mmol·L^(-1 )MgCl_2溶液中孵育180min的优化结合条件下,VC2适配体与c-di-GMP特异性结合,VC2/g20a适配体与cGAMP特异性结合;c-di-GMP对VC2适配体的半数效应浓度(EC50)为(89±1.7)nmol·L^(-1),cGAMP对VC2/g20a适配体的半数效应浓度为(309±4.5)nmol·L^(-1);VC2和VC2/g20a能够分别检测低至5nmol·L^(-1)和20nmol·L^(-1)的c-di-GMP和cGAMP;并且发现转录的RNA混合物在未纯化的情况下同样能够检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。这种方法可以简单快速的检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,并且为研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潜在可能。

氨基酸代谢变化引起的c-di-GMP稳态波动对大肠杆菌致病过程中菌毛合成的影响

[目的]细菌能够合成多种信号分子,调控自身在各种营养状态或应激条件下的生长代谢及毒力发挥。第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)在致病菌感应氨基酸饥饿(AAS)的过程中发挥重要作用,调控多种生理活动并显著影响其毒力发挥。本文旨在研究c-di-GMP在尿道致病性大肠杆菌(UPEC)尿道定殖及毒力发挥过程中的作用。[方法]采用尿液培养UPEC,结合转座子突变技术筛选氨基酸代谢相关生长缺陷基因,采用基因敲除技术、特定氨基酸回补及小鼠尿道感染模型验证尿液生长及尿道定殖缺陷表型;借助表达谱数据、RT-qPCR及β-半乳糖苷酶活性测定法筛选并鉴定受氨基酸饥饿影响的毒力基因及c-di-GMP相关基因;通过多基因敲除及回补技术、凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定c-di-GMP对毒力基因的调控机制。[结果]精氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸代谢失衡引起UPEC在尿液中生长缺陷,尿道定殖能力显著下降及局部c-di-GMP稳态破坏;YciR及YcgF相关c-di-GMP体系失衡显著下调菌毛基因簇表达;YciR通过调节子MlrA直接调控P菌毛基因簇表达;YcgF通过下游配对调节子YcgE直接调控P菌毛基因簇表达。[结论]c-di-GMP感应尿道定殖过程中的特定氨基酸饥饿,调控菌毛等黏附因子合成,促进UPEC完整毒力发挥。

WspR在大肠杆菌中的表达及其对c-di-GMP合成的影响

可得胶是土壤农杆菌ATCC31749分泌的一种胞外多糖,大多数细菌胞外多糖的合成受控于新近发现的第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP).细胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解两条途径调控.在结构上,通常DGC含有GGDEF结构域,PDE含有EAL结构域.研究表明从绿脓杆菌(P.aeruginosa)中得到的类趋化系统蛋白WspR具有GGDEF结构域,具有DGC活性.本实验将WspR转入大肠杆菌中得到了表达,并用颜色反应得到证实c-di-GMP在E.coli大量合成.为进一步研究ATCC31749中WspR的作用机制,促进可得胶的合成提供切实可行的依据.

c-di-GMP在低温好氧颗粒污泥形成过程中的作用

在低温条件下运行好氧颗粒污泥反应器,絮状污泥颗粒化过程中信号分子可通过传导作用引起各层物质之间的组分变化,通过研究胞外聚合物及污泥相关疏水性的变化规律,并观察此过程中微生物菌群的群落演替特点,揭示环二鸟苷酸(c-di-GMP)在低温好氧颗粒污泥形成过程中的变化规律与影响作用.结果表明:接种污泥在颗粒化过程中,胞外聚合物含量从48mg/gMLVSS增长至139mg/gMLVSS,其中以TB层蛋白质增长为主,在颗粒化过程中,c-di-GMP含量由62?g/gMLVSS增至600?g/gMLVSS,始终影响微生物运动及生物膜形成,促使具备胞外聚合物分泌功能的菌群加快分泌胞外聚合物,促进好氧颗粒污泥的形成.各个阶段污泥中微生物种群存在较大差异,在反应器运行初始阶段与c-di-GMP合成相关的菌群占据优势,同时在后期表现出较好的脱氮除磷能力,在低温条件下好氧颗粒污泥微生物菌群发生演替并最终形成稳定的菌群结构.

STM2503调控鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成和压力适应性

【目的】通过揭示c-di-GMP通路基因STM2503调控鼠伤寒沙门菌生物被膜形成,进而影响其环境应激能力的机制,以期挖掘调控鼠伤寒沙门菌压力适应性的关键因子,为防控策略的制定提供理论依据。【方法】以λ-Red同源重组方法构建STM2503缺失株,并利用质粒PBAD表达STM2503来构建相应的基因回补株。然后通过检测不同STM2503表达水平菌株中信号分子c-di-GMP的含量揭示STM2503对菌株胞内c-di-GMP水平的影响。接下来,利用细菌运动性检测、结晶紫染色等试验检测了STM2503对菌株运动性和生物被膜形成能力的影响,并利用实时荧光定量PCR从基因层面揭示其对菌株运动性和生物被膜形成的调控机制。最后,通过抗生素处理、氧化应激、消毒剂应激等试验探究了STM2503对鼠伤寒沙门菌压力适应性的影响。【结果】与野生株(WT269)相比,STM2503的缺失使菌株胞内c-di-GMP含量升高了37.51%(P<0.001),且不影响菌株的正常生长。另外,STM2503的缺失提高了菌株各胞外基质合成基因的表达水平,使缺失株胞外多糖、胞外DNA和胞外蛋白质含量分别增加了10.30%(P<0.01)、33.59%(P<0.001)和27.60%(P<0.01),最终使菌株的生物被膜形成能力显著增强了1.63倍(P<0.01)。并且,269ΔSTM2503通过降低鞭毛合成相关基因fliA与flhC的表达使其在6 h的运动直径较野生株相比下降了17.22%(P<0.01)。这些变化最终导致269ΔSTM2503菌株对头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林等β-内酰胺类抗生素的敏感性降低1—3倍,且在氧胁迫和SDS消毒剂胁迫下表现出了更强的适应能力。【结论】STM2503参与信号分子c-di-GMP的降解,并通过抑制胞外基质的合成降低鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成能力,通过上调鞭毛合成基因的表达增强菌株的运动性,进而降低菌株的耐药性和环境压力适应能力,本研究为鼠伤寒沙门菌关键防控靶点的挖掘提供了理论基础。

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学分析

【背景】铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一。广泛存在于细菌中的第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)对细菌生理生化功能具有重要的调节作用。铜绿假单胞菌PAO1中存在参与c-di-GMP代谢的基因PA2072。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学功能。【方法】运用PCR及分子克隆技术构建PA2072基因及各结构域的自杀载体,运用基因敲除方法获取PA2072基因的3个突变株;利用泳动性(swimming)、蜂群运动(swarming)、蹭行运动(twitching)和生物膜定量实验对细菌进行初步的表型分析,进一步通过刚果红染色法对菌株进行分析。【结果】成功构建PA2072基因敲除突变菌株及回补菌株;生物膜定量结果发现基因PA2072的敲除会影响细菌生物膜的形成,PA2072蛋白的不同结构域对生物膜的合成也起到了重要作用;细菌运动能力检测中发现PA2072相关基因的敲除对细菌运动能力也有一定影响。刚果红平板检测结果显示,与野生型PAO1菌株相比,PA2072敲除菌株菌苔呈红色,提示其胞内c-di-GMP含量升高。【结论】基因PA2072的敲除影响了铜绿假单胞菌胞的表型,可能由于铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP水平变化引起,该结果为进一步研究基因PA2072的生物学功能奠定了基础。

STM1827在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成及环境应激中的调控作用

旨在研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)通路代谢基因STM1827对鼠伤寒沙门菌生物被膜的调控及其相关生物学功能。首先通过测定c-di-GMP水平分析STM1827对c-di-GMP合成的影响;进一步通过生物被膜及运动性等试验分析STM1827对生物被膜形成的作用;最后通过氧胁迫和消毒剂胁迫等试验分析STM1827对鼠伤寒沙门菌环境应激适应能力的影响。结果显示,缺失株269ΔSTM1827胞内c-di-GMP水平与野生株相比升高了33.16%;在生物被膜形成方面,缺失株269ΔSTM1827生物被膜形成能力与野生株相比上调了2.19倍,生物被膜相关胞外多糖含量增加1.3倍,且胞外多糖合成基因表达量显著升高(P<0.0001);在运动性方面,与野生株相比,269ΔSM1827运动性降低了13%,鞭毛相关基因表达量显著降低(P<0.05);在氧应激和消毒剂应激条件下,STM1827基因缺失增强鼠伤寒沙门菌在氧胁迫和SDS消毒剂胁迫下的适应能力。研究表明,STM1827可以降解c-di-GMP,且通过抑制胞外多糖的合成与促进细菌运动性,进而抑制生物被膜形成,最终导致细菌在氧胁迫和消毒剂胁迫下的耐受性降低。本研究为鼠伤寒沙门菌病作用靶点的筛查和防控措施的开发提供理论基础。

检测大肠杆菌内c-di-GMP水平的双荧光素报告质粒的构建及应用

细菌通过调控第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)而促进其适应环境、存活及致病。【目的】本研究旨在建立有效的c-di-GMP水平检测方法,为大肠杆菌内c-di-GMP水平检测提供便利条件。【方法】根据c-di-GMP核糖开关受体的调控方式、荧光报告基因等设计引物,通过重叠聚合酶链反应(overlap polymerase chain reaction,overlap PCR)和同源重组酶构成基于核糖开关的双荧光素报告质粒pAmCherry-Vc2EGFP(pACVcE),然后构建c-di-GMP代谢基因过表达菌株和缺失菌株,利用pACVcE检测大肠杆菌内c-di-GMP水平。【结果】Overlap PCR扩增产物与目的靶序列一致,测序结果证明pACVcE序列正确。表达c-di-GMP合成酶DgcZ的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著升高,而表达c-di-GMP降解酶PdeK的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著降低。禽致病性大肠杆菌的胞内c-di-GMP水平检测发现c-di-GMP降解酶基因pdeK缺失后胞内的c-di-GMP水平显著升高。【结论】本研究构建了基于核糖开关的双荧光素报告质粒,可方便、快速检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平。

绿原酸对不同水平环二鸟苷酸铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的:研究绿原酸对不同水平环二鸟苷酸(c-di-GMP)铜绿假单胞菌(P.a)早期和成熟生物被膜(BF)的抑制作用。方法:用液体培养基稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。构建3种P.a菌株—PAO1、P.a胞内c-di-GMP高表达菌株(PAO1ΔwspF)和P.a胞内c-di-GMP低表达菌株(PAO1/Plac-yhjH)BF体外模型,分别分为空白对照组和不同浓度的绿原酸(1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC)组。结晶紫染色半定量法测定3 d及7 d载体表面BF总量,连续稀释法计数绿原酸作用3 d及7 d后BF内活菌,观察绿原酸对运动能力的影响。结果:在绿原酸的作用下,无论3 d还是7 d载体表面所形成BF均少于空白对照组(P<0.05),BF内活菌均较空白对照组少(P<0.05),3种菌株的运动区域直径均小于空白对照组(P<0.05)。结论:绿原酸对不同水平c-diGMP P.a早期和成熟BF均具有抑制作用,对BF内活菌具有良好的杀灭效果,影响其运动能力。

SadC合成的c-di-GMP信号通过PilZ和FlgZ调节铜绿假单胞菌的泳动能力

【目的】探究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)SadC合成的环二鸟苷酸(cyclic di-GMP,c-di-GMP)信号与PilZ结构域受体间的信号传递关系,分析鉴定出特定PilZ结构域受体的调控功能和机制。【方法】SadC突变株和过表达菌株的构建及泳动能力分析;SadC过表达背景下,PilZ结构域受体突变各菌株的泳动表型分析和筛选;基因敲除和过表达解析筛选出的PilZ结构域受体功能;定点突变和遗传互补检测筛选出的PilZ结构域受体是否参与SadC合成c-di-GMP对泳动能力的调控。【结果】SadC通过影响鞭毛功能而非鞭毛形成抑制铜绿假单胞菌的泳动能力;PilZ结构域受体突变菌株筛选发现PilZ、FlgZ这2个受体参与了SadC介导的泳动能力抑制;功能分析发现ΔpilZ或ΔflgZ的泳动能力相比野生型PA14显著增强,而过表达PilZ或FlgZ则抑制了泳动能力;定点突变和回补实验发现PilZ第10位和FlgZ第140位氨基酸R对其介导SadC负调控泳动能力至关重要,多序列比对分析表明这些位点是其保守的c-di-GMP结合位点。【结论】SadC合成的c-di-GMP信号通过PilZ和FlgZ调控铜绿假单胞菌的泳动能力。

AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成

【目的】综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制。【方法】利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(ΔaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测ΔaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取ΔaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入ΔaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。【结果】表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上。【结论】AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一。

环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性研究

目的:通过构建环二鸟苷酸降解酶磷脂酶D基因突变株,探讨环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性。方法:采用基因工程技术构建磷脂酶D基因突变质粒,通过同源重组转化至野生型铜绿假单胞菌PAO1,抗性筛选获得基因突变株bf-。扫描电子显微镜下观察基因突变株与野生菌株生物膜表型的差异。结果:与野生菌株相比,基因突变株bf-细菌微克隆的形成增加,有利于细菌在导管材料表面形成生物膜。结论:环二鸟苷酸的增加可促进细菌生物膜的形成,与铜绿假单胞菌引起的院内感染和耐药性密切相关。

鱼腥蓝细菌PCC7120 alr3504基因缺失突变体的构建及表型分析

c-di-GMP是新发现的真细菌所特有的第二信使,其合成和降解由双鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶分别完成。经生物信息学分析,鱼腥蓝细菌PCC7120基因alr3504可能编码含有保守GGDEF结构域的双鸟苷酸环化酶。【目的】为了鉴定该基因的功能,【方法】采用标记置换方法将alr3504缺失。【结果】敲除该基因后,发现缺失突变体的形态、生长速度及异形胞发育与野生型无明显差异,但在盐胁迫条件下,突变体比野生型对钠盐更敏感。【结论】可见alr3504虽不直接影响异形胞发育,但参与了其它信号途径,研究结果为阐明蓝细菌丰富而复杂的信号转导机制奠定了基础。