龙州凤仙花ImLHY和ImC4H基因克隆及表达分析

【目的】对龙州凤仙花晚期下胚轴蛋白基因(ImLHY)和肉桂酸-4-羟基化酶基因(ImC4H)进行克隆及表达分析,探讨龙州凤仙花旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区颜色差异,克隆LHY和C4H基因,为凤仙花彩斑分子调控机制及花色改良和新品种培育提供理论依据。【方法】以龙州凤仙花为材料,测定其旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区色度值以及总花色苷和总黄酮含量,对ImLHY和ImC4H基因进行克隆,利用生物信息学软件对其进行序列特征、蛋白结构和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR检测ImLHY和ImC4H基因在不同关键发育时期(花苞期、盛花期和衰败期)旗瓣和翼瓣不同着色区的表达模式。【结果】旗瓣和翼瓣的彩斑区a*(红度值)和C*(彩度值)均高于非斑区,非斑区的L*(亮度值)大于彩斑区;旗瓣彩斑区b*(黄度值)高于旗瓣非斑区,而翼瓣彩斑区与非斑区的b*(黄度值)差异较小,且旗瓣和翼瓣的彩斑区总花色苷和总黄酮含量均高于非斑区。克隆获得ImLHY和ImC4H基因的cDNA全长分别为1698和1518 bp,分别编码565和505个氨基酸残基,GenBank登录号分别为OR096417和OR096418。ImLHY和ImC4H蛋白均为亲水性不稳定蛋白,均不具有跨膜结构域。ImLHY蛋白有1个Myb DNA-binding保守结构域,且具有MYB转录因子家族的SANT结构域,定位于细胞核中;ImC4H蛋白含有1个P450超家族结构域(PLN02394),定位于内质网上。ImLHY和ImC4H蛋白分别与喜马拉雅凤仙花LHY和C4H的氨基酸序列相似性达68%和94%,且在系统发育进化树中二者分别均与喜马拉雅凤仙花LHY和C4H蛋白聚在一支。ImLHY和ImC4H基因在3个关键发育时期(花苞期、盛花期和衰败期)旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区中均有表达,且整体表现为在盛花期的相对表达量较高;在盛花期时,ImLHY和ImC4H基因在旗瓣的相对表达量均表现为彩斑区显著高于非斑区(P<0.05),在翼瓣的相对表达量均表现为非斑区高于彩斑区。【结论】ImLHY和ImC4H基因在盛花期时主要调控旗瓣彩斑形成,而在翼瓣主要调控非斑区形成,推测旗瓣和翼瓣的彩斑形成存在不同的调控机制。

青稞C4H基因的克隆及组织表达分析

为揭示大麦中黄酮合成的分子调控机制,利用反转录PCR结合同源克隆和RACE技术首次从青稞(裸大麦)叶片中克隆获得肉桂酸-4-羟化酶基因(HvC4H)的全长cDNA序列(Genbank登录号:KF927086),总长度1951 bp,ORF为1518 bp,编码505个氨基酸,等电点PI=9.01,平均亲水指数(GRAVY)为-0.170,属于亲水性碱性蛋白,高级结构分析表明其具有细胞色素P450家族保守域及C4H特异的功能性活性位点。利用实时荧光定量PCR分析胚乳发育5个时期不同组织(茎、叶及子粒)的表达情况,结果显示HvC4H基因在青稞胚乳发育期的表达情况存在着明显的组织差异性,在茎中的表达量最高。本研究为通过调控C4H基因的表达从而提高大麦黄酮的含量奠定了分子生物学基础,对于改良大麦的品质、抗性、生长发育等性状具有重要意义。

芒果C4H基因的克隆及其表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一,其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52,分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图;通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量最高,而绿色的桂七品种中表达量最低。

榅桲C4H基因的克隆、序列分析及表达

【目的】肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)是调节木质素合成的关键基因,榅桲是新疆特色经济果树之一。目前,有关榅桲C4H基因的序列信息尚不明确。为了获得该基因的序列信息及其在果实不同发育时期的差异性表达规律,为深入研究该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果实为研究材料,基于GenBank已登录近源物种的C4H基因的cDNA序列,提取其果实的总RNA并反转录为cDNA,利用同源克隆的方法获得榅桲C4H基因的cDNA序列,并对该序列进行生物信息学分析,同时检测在榅桲果实开花后不同时间点C4H基因表达量的差异。【结果】同源克隆结果表明:C4H基因编码区的序列全长为1 518 bp,编码505个氨基酸,其蛋白的分子质量为58.28 kD。生物信息学分析结果显示:榅桲C4H蛋白为亲水性不稳定蛋白质,其二级结构以α-螺旋和无规卷曲结构为主。系统进化分析结果显示:榅桲C4H蛋白与甜樱桃(Prunus avium,XP021806844.1)、山杏(Prunus armeniaca,VVA16404.1)的C4H蛋白同源性均较高,其相似性分别为92.87%和91.24%。实时荧光定量PCR的结果显示:随着榅桲果实的发育,在开花后10 d的果肉中C4H基因的表达量最高,随着果实的不断发育,果肉中C4H基因的表达量逐渐减少。【结论】成功获得了榅桲C4H基因全长编码区序列,并发现了C4H基因在果实发育初期的表达最高,这与榅桲果实的木质化程度密切相关。

杜仲C4H基因cDNA全长序列特征分析

杜仲肉桂酸-4-羟化酶(C4H)是植物苯丙素类物质合成的关键酶之一。为了探明生物合成杜仲绿原酸的分子调控机制,对杜仲C4H基因全长cDNA进行了系统的生物信息学研究,鉴定了2个基因家族成员,分别为EuC4H1和EuC4H2,其全长cDNA分别为1 641 bp和1 611 bp;编码547和537个氨基酸,相对分子质量分别为62.94 kD和60.96 kD,等电点分别为9.34和8.85,均为疏水性不稳定蛋白质,其中EuC4H2是分泌蛋白;二级结构均是以α-螺旋、β-折叠、螺环结构并存的混合型结构,都属于Cypx超家族。

七种药用植物c4h基因密码子偏好性及聚类分析

为了深入研究药用植物基因特性,利用CodonW和SPSS18.0软件对丹参、黄芪、黄芩、忍冬、桑树、野甘草、长春花共7种药用植物c4h基因密码子进行偏好性和聚类分析。结果表明：7种药用植物c4h基因的有效密码子数介于46.1~55.92,密码子使用偏好性弱,5种药用植物倾向于GC结尾的密码子,2种倾向于AT结尾的密码子。7种药用植物经聚类分析分为两大类,长春花与黄芪为一大类,另一大类中,丹参与黄芩为一类,野甘草、桑树和忍冬为一类。

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pCC4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50mg/LKan的培养基上对T0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4HcDNA全长1735bp,开放阅读框1518bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性,2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.

茶树PAL、C4H与4CL基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】分析茶树PAL、C4H和4CL基因家族成员的基本特征,探索它们与苯乙醇樱草糖苷含量性状之间的因果关系,对于深入研究PAL、C4H和4CL基因家族在茶树上的生物学功能具有重要意义。【方法】基于生物信息学方法及转录组测序技术,分析PAL、C4H和4CL基因成员在茶树基因组中的分布、理化性质、基因结构、系统发育关系、启动子顺式作用元件与表达特性,以及探索茶树PAL、C4H和4CL基因成员在苯乙醇樱草糖苷含量差异显著的茶树新品系(高糖苷和低糖苷品系)新梢中的表达差异。【结果】7个CsPAL、4个CsC4H与4个Cs4CL基因分布在9条染色体上。所有CsPAL均只有1个内含子;除CsC4H4外,其他CsC4H成员均含有2个内含子;Cs4CL成员均含有多个内含子。系统进化分析表明,它们与杨树PAL、C4H和4CL蛋白的亲缘关系较近。基因结构和保守基序分析显示,亲缘关系较近的基因,其基因结构和保守基序的组成也较为相似。启动子顺式作用元件预测发现,CsPAL、CsC4H与Cs4CL基因成员的启动子区域内含有多种顺式元件,包括逆境胁迫响应、生长发育相关以及激素响应等多种顺式元件。转录组分析发现,大多数CsPAL、CsC4H与Cs4CL的成员表现为组织特异性表达,且会受到激素、低温、干旱及高盐的诱导。CsPAL7、CsC4H4与Cs4CL3在苯乙醇樱草糖苷含量明显差异的品系中存在表达差异,CsPAL7在高糖苷品系中的表达量要大于低糖苷品系,CsC4H4与Cs4CL3在低糖苷品系中的表达量均显著高于高糖苷品系,推测这3个家族基因的表达可能对茶树新梢中苯乙醇樱草糖苷的形成起不同的作用。【结论】本研究为PAL、C4H和4CL基因的功能分析提供了有用的信息,其家族成员可作为茶树分子育种的候选基因。

慈竹木质素合成关键基因C4H克隆及组织表达分析

研究以慈竹为材料,利用RACE技术克隆慈竹C4H基因,并对其进行生物信息学分析和组织表达分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 573bp,编码区为1 524 bp,编码507个氨基酸;蛋白分子量为58.13 kD,该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JN571418。氨基酸序列和结构分析显示C4H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与绿竹和燕麦的C4H基因具有很高的同源性,分别达到98.42%和90.14%。慈竹、绿竹和燕麦的C4H基因编码蛋白三级结构相似,均含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链较少。RT-PCR分析结果表明,慈竹C4H基因在笋和茎的稍幼嫩部位表达量较弱,在笋和茎的其它部位的表达量较强,该基因可能与慈竹木质素的生物合成有关。

滇水金凤C4H基因的克隆及序列分析

滇水金凤(Impatiens uliginosa Franch.)是凤仙花科凤仙花属的一年生或多年生草本植物,具有较高的观赏价值、生态价值和药用价值。C4H是花色素苷合成中的第二步重要酶,其蛋白质活性直接影响着植物中类黄酮化合物的合成,从而影响着植物花色的形成。本研究以滇水金凤的整个花器官为材料,通过提取其总RNA结合RT-PCR及RACE技术克隆出2个特异片段,其cDNA全长序列分别为1518 bp和1512 bp,编码505 aa和503 aa,分别命名为C4H1和C4H2。运用生物软件对其编码的蛋白质进行分析,发现2个蛋白均为疏水性不稳定蛋白,其三级结构存在一定差异;经系统发育树分析推测其二者为旁系基因家族。通过进一步提取其总DNA结合PCR技术获得了滇水金凤C4H1和C4H2的全长g DNA序列,分别为1689 bp和1667 bp。结果将为后续探究滇水金凤花色的形成及变异机理、凤仙花的花色改良及新品种的培育提供一定的基础数据和科学依据。

烟草C4H2基因的克隆与表达特性分析

以中烟202无菌幼苗为供试材料克隆出C4H2基因的CDS区,对该基因进行生物信息学分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌中对重组质粒进行诱导表达及纯化分析,考查其在不同组织中的表达特性,以及叶片中黄酮含量变化趋势。结果表明:1)NtC4H2蛋白属于细胞色素P450超家族成员,有1个跨膜区,为不稳定亲水蛋白,二级结构中α螺旋和无规则卷曲占比较高;2)重组NtC4H2蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于表达细菌中;3)Nt C4H2基因在烟草不同组织的表达水平为下部叶<茎<中部叶<根<上部叶,NtC4H2蛋白活性大小与基因表达量变化趋势相同,表明试验植株在不同生命阶段中的木质化进程会直接影响该基因在各个组织中的表达丰度;4)不同采样时间内上部叶中Nt C4H2基因表达量有明显波动,48 h表达量达峰值,确定了该基因表达模式与叶中黄酮的积累呈正相关。

茶树C4H基因的克隆及生物信息学分析

克隆验证茶树肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)基因并预测C4H基因的生物学功能。提取茶树新鲜叶片总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应克隆出茶树C4H基因,利用生物信息学软件分析C4H基因编码蛋白质的保守结构域、理化性质、亚细胞定位、跨膜域和信号肽、同源性、系统进化等。结果表明:茶树C4H基因包含一个1518 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码505个氨基酸;保守结构域分析显示,茶树C4H基因编码的蛋白包含一个p450超家族蛋白的结构域(PLN02394),分子量为58.16 kDa,理论等电点为9.29,为亲水性的不稳定蛋白质,定位在内质网,无信号肽,不含有跨膜结构域,以α-螺旋和无规则卷曲为主构成其蛋白二级结构,C4H基因在氨基酸水平与油茶树同源性最高(92%)。本研究成功克隆了茶树C4H基因,分析了其生物学功能,为进一步深入研究C4H基因的功能及茶树合成的分子机理奠定了初步的理论基础。

斑地锦肉桂酸4-羟基化酶基因及启动子的克隆与分析

槲皮素属于黄酮类化合物,是斑地锦主要药效成分之一,在槲皮素生物合成过程中,肉桂酸4-羟基化酶(C4H)是一个关键酶。为了阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制,应用同源克隆结合RACE技术、Tail-PCR,获得C4H基因编码区及其启动子序列,RT-qPCR技术检测基因在不同生长期不同组织中的表达模式,并对启动子进行生物信息学分析。结果显示,斑地锦C4H基因编码区为1518 bp,编码505个氨基酸,与麻疯树C4H氨基酸序列的相似性高达93.1%。RT-qPCR实验表明,斑地锦中C4H基因在苗期根中表达水平最高。克隆到的C4H基因启动子长约为1440 bp,内含TAAT-box、CAAT-box等序列。此结果丰富了C4H基因资源,也为进一步研究斑地锦C4H基因功能及表达调控提供基础。