基于RAP1信号通路探讨右归丸延缓膝骨关节炎的软骨退变

目的通过右归丸治疗膝骨关节炎(KOA)模型大鼠,观察大鼠关节软骨形态及检测右归丸对RAP1信号通路表达和大鼠血清中的炎性因子表达,探讨右归丸对RAP1信号通路的表达及防治KOA的作用机制,为治疗提供理论基础。方法72只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机数字表法分为假手术组12只和造模组60只。造模组采用改良Hulth法建立膝关节OA模型,假手术组接受假手术。将造模成功的大鼠分为模型组(n=11)、右归丸低剂量组(n=12)、右归丸中剂量组(n=12)、右归丸高剂量组(n=12)及塞来昔布组(n=12)。给药阶段模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液;右归丸低剂量组为等效浓度的1/2为0.5 g/d、右归丸中剂量组等效浓度为1 g/d、右归丸高剂量组为等效浓度2倍为2 g/d,塞来昔布组配置成悬浮(等效浓度为0.0072 g/d)。驱赶7周后检测并比较各组大鼠软骨病理,血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量,以及大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平。结果各组大鼠软骨病理检测结果显示:假手术组大鼠软骨组织未见异常,模型组大鼠关节软骨部分区域出现明显缺损,右归丸低剂量组大鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻,而中、高剂量组及塞来昔布组大鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。右归丸对KOA大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-18含量与模型组相比,右归丸高、中、低剂量组和塞来昔布组在大鼠血清中表达显著降低,差异具有统计学意义。与软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路活化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果提示,在KOA发生时,RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号转导通路激活,介导软骨组织中炎症反应及细胞凋亡的发生,这与以往研究结果一致。右归丸干预后,软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论右归丸能够抑制KOA大鼠软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路的活化,降低炎性因子表达,从而延缓软骨退变。

优化新生脉散方调控β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的 基于β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组10只和手术组40只,采用左冠状动脉前降支结扎法建立心力衰竭大鼠模型。将成模大鼠随机分为模型组、卡托普利组和中药低、高剂量组,每组8只,给药组分别予相应药物灌胃4周。超声心动图测定大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS),测定心、肺质量并计算心、肺脏器系数,组织病理学观察心肌纤维化程度,ELISA测定血清N端脑利钠肽前体(NT-ProBNP)及心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)含量,免疫组化检测心肌组织β1肾上腺素受体(β1-AR)、cAMP阳性表达,Western blot检测心肌组织β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低(P<0.01),心、肺脏器系数明显升高(P<0.01);心肌细胞数目减少、胶原容积分数升高、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比增加(P<0.01),血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量明显升高,心肌组织cAMP含量明显降低(P<0.01),心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达明显降低(P<0.01),β1-AR、腺苷酸环化酶(AC)1、cAMP、p-蛋白激酶A(PKA)、p-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达明显降低,p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,给药组不同程度增加大鼠LVEF、LVFS,降低心、肺脏器系数;增加心肌细胞数目、减少胶原容积分数和Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比,下调血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量,上调cAMP含量,增加心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达,上调β1-AR、AC1、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达,抑制p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达,其中中药高剂量组和卡托普利组作用更明显(P<0.01,P<0.05)。结论 优化新生脉散方能减轻心力衰竭大鼠心肌纤维化程度,改善心肌肥厚和重构,增加左心室收缩力,其机制可能与激活β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

cAMP/Epac/Rap1信号通路调控NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF及酸枣仁皂苷A的作用研究

目的研究环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷结合蛋白(Epac)/Ras相关蛋白1(Rap1)信号通路是否参与调控NG2细胞分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脑源性神经营养因子(BDNF)及酸枣仁皂苷A(JuA)的作用。方法体外培养NG2细胞,分为对照组、百日咳毒素(PTX)组、非环状核苷酸Epac拮抗剂(ESI-09)组、酸枣仁皂苷A(JuA)组、艾司唑仑(阳性药)组。采用CCK-8法检测不同浓度JuA对NG2细胞存活率的影响,RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA及蛋白的表达情况。结果与对照组比较,PTX组降低IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白的表达(P<0.01),增加BDNF和cAMP mRNA和蛋白的表达(P<0.01);ESI-09组增加IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白的表达(P<0.05),降低BDNF、Epac和Rap1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01);JuA组、阳性药组均增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论cAMP/Epac/Rap1信号通路可介导NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF,JuA可能作用于cAMP/Epac/Rap1信号通路影响NG2细胞分泌BDNF。

基于神经递质和5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路研究黄连温胆汤对失眠大鼠的治疗作用及机制

目的研究黄连温胆汤对失眠大鼠的行为学指标、神经递质水平及5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路的影响,探讨其对失眠大鼠的治疗作用及机制。方法将SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地西泮组(2 mg·kg^(-1))及黄连温胆汤低、高剂量组(5.85、11.70 g·kg^(-1))。黄连温胆汤低、高剂量组模型复制前给予相应剂量的黄连温胆汤进行预防性治疗8 d。除正常组外,其余各组腹腔注射对氯苯丙氨酸(DL-4-Chlorophenylalanine,PCPA)复制失眠模型,成模后给予相应剂量药物干预治疗8 d。观察大鼠每日状态,监测体质量,进行旷场实验(行为学监测)并称取全脑质量计算全脑系数。ELISA法检测血清中脑源性神经营养因子(BDNF)及神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量,脑干中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、γ氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量,下丘脑中5-羟色胺(5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)及环一磷酸腺苷(cAMP)含量。Western Blot法检测下丘脑中5-HT_(1A)受体蛋白和Gα(i)蛋白表达水平。结果①与正常组比较,模型组大鼠活动总距离、总时间均明显增加(P<0.01),中心区域持续时间明显减少(P<0.01);全脑系数明显降低(P<0.01);血清中BDNF含量明显降低(P<0.01),GFAP含量明显升高(P<0.01);脑干中NE、DA、Glu及Glu/GABA水平均明显升高(P<0.01),GABA水平明显降低(P<0.01);下丘脑中5-HT、5-HIAA及cAMP水平均明显降低(P<0.01),5-HT_(1A)受体蛋白表达水平明显下调(P<0.01),Gα(i)蛋白表达水平明显上调(P<0.01)。②与模型组比较,黄连温胆汤各剂量组大鼠活动总距离、总时间均明显减少(P<0.01),高剂量组大鼠中心区域持续时间明显增加(P<0.01);高剂量组大鼠全脑系数明显升高(P<0.01);各剂量组大鼠血清中BDNF含量明显升高(P<0.01),GFAP含量明显降低(P<0.01);各剂量组大鼠脑干中DA及Glu/GABA水平明显降低(P<0.05,P<0.01),高剂量组的NE及Glu水平明显降低(P<0.01)而GABA水平均明显升高(P<0.01);各剂量组大鼠下丘脑中5-HT、5-HIAA、cAMP水平均明显升高(P<0.01),5-HT_(1A)受体蛋白表达水平上调(P<0.05),Gα(i)蛋白表达水平下调(P<0.05,P<0.01)。结论黄连温胆汤可改善大鼠行为学指标,可能通过调控5-HT等神经递质及5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路相关的蛋白表达,从而改善大鼠失眠症状,减轻大鼠焦虑及躁狂的状态,激发大鼠自发活动和空间探索能力。

转染LKB1基因乳腺癌细胞与胚胎发育信号通路及cAMP/PKA通路的关系

目的探讨抑癌基因LKB1与胚胎发育(Sonic Hedgehog,SHH)信号通路、cAMP/PKA信号通路之间的相互关系。方法抑癌基因LKB1转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,分MDA-MB-231组(231组)和转染LKB1基因的MDA-MB-231(LKB1组)两组,每组分别采用0、5×10-6、1×10-5、2×10-5 mol/L等4种浓度的SHH信号通路抑制剂环靶明(cyclopamine)作用于细胞,各小组细胞分别用RT-PCR法和Western blot法检测SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA表达水平和蛋白表达水平,用cAMP、PKA试剂盒检测cAMP、PKA数值水平。结果 LKB1组的细胞通过不同剂量环靶明抑制后,SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA和蛋白表达水平相应较231组明显抑制,且与环靶明剂量呈正相关,抑制效果在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时最明显,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,抑制效果保持不变。231组和LKB1组中细胞的PKA和cAMP数值均随环靶明浓度增加而增高,至10×10-6 mol/L时达到最高,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,两组中的PKA和cAMP数值保持不变。在相同环靶明浓度下,LKB1组中PKA和cAMP数值高于231组中相应数值。结论抑癌基因LKB1协同环靶明抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的SHH信号通路的同时亦协同增加cAMP/PKA信号通路的表达,且在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时效果最明显;推测存在LKB1-SHH-cAMP/PKA通路。

老年非创伤性股骨头坏死组织中Rap1-PI3K/Akt信号通路表达特点及作用

目的探讨老年非创伤性股骨头坏死组织中Ras相关蛋白(Rap)1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路表达特点及作用。方法老年非创伤性股骨头坏死患者50例为非创伤性股骨头坏死组,同期老年创伤性股骨头坏死患者50例为创伤性股骨头坏死组。非创伤性股骨头坏死组取两个区域(坏死区、正常区)骨组织样本,创伤性股骨头坏死组取正常区域骨组织标本,进行苏木精-伊红(HE)和免疫组化染色,实时荧光定量PCR、Western印迹检测Rap1、血管内皮生长因子(VEGF)、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平。结果HE染色显示,非创伤性股骨头坏死区域软骨细胞数量明显减少,软骨下骨小梁增厚、断裂,细胞核消失,出现软骨陷窝,周围新生毛细血管和纤维母细胞等肉芽组织长入坏死组织,出现肉芽组织增生。免疫组化染色显示,非创伤性股骨头坏死组组织坏死区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达强度(■)弱于非创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)、创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)。非创伤性股骨头坏死组骨组织坏死区的Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平明显低于非创伤性股骨头坏死组骨组织正常区、创伤性股骨头坏死组骨组织正常区(P<0.05);两组骨组织正常区Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论Rap1-PI3K/Akt信号通路激活受限造成血管内皮损伤,进而导致老年非创伤性股骨头坏死。

虎杖苷调节cAMP/EPAC1/RAP1信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨虎杖苷调节环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷结合蛋白1(EPAC1)/Ras相关蛋白1(RAP1)信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 研究时间为2022年8月-2023年8月。以子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,分为空白组、虎杖苷-L组(25μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-M组(50μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-H组(100μmol/L虎杖苷)、Forskolin组(cAMP激活剂,100μmol/L Forskolin)以及虎杖苷-H+Forskolin组(100μmol/L虎杖苷+100μmol/L Forskolin)。分别以克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、TUNEL法、CCK-8法、Western Blot检测细胞克隆数、侵袭、迁移、凋亡、增殖及EPAC1、RAP1、凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达。采用ELISA法检测细胞培养基中cAMP水平。结果 与空白组相比,Forskolin组细胞克隆数[(195.66±19.62)个]、侵袭数[(281.52±28.22)个]、迁移率[(82.61±8.31)%]、增殖率[(125.64±12.59)%]、cAMP水平[(1 385.54±138.56)pmol/ml]、EPAC1(1.56±0.16)、RAP1(2.11±0.22)、MMP-9(1.88±0.19)表达显著增加,凋亡率[(5.47±0.56)%]、Cleaved Caspase-3(0.26±0.03)表达均降低(均P<0.05),虎杖苷-L组、虎杖苷-M组、虎杖苷-H组细胞克隆数[(105.34±10.57)个、(65.34±6.58)个、(42.27±4.25)个]、侵袭数[(185.72±18.66)个、(145.47±14.58)个、(112.59±11.29)个]、迁移率[(40.21±4.06)%、(31.12±3.12)%、(21.34±2.15)%]、增殖率[(68.37±6.86)%、(48.67±4.88)%、(35.24±3.55)%]、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达显著降低,凋亡率[(19.85±1.99)%、(27.34±2.77)%、(36.44±3.66)%]、Cleaved Caspase-3表达均增加(均P<0.05)。与Forskolin组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、增殖率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著降低,凋亡率、Cleaved Caspase-3表达均显著增加(均P<0.05)。与虎杖苷-H组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著增加,凋亡率、增殖率、Cleaved Caspase-3表达均显著降低(均P<0.05)。结论 虎杖苷可抑制子宫内膜癌细胞恶性生物学行为发展,可能与抑制cAMP/EPAC1/RAP1信号通路有关。

缺氧诱导因子-1信号转导通路的研究进展

缺氧诱导因子 1(HIF 1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子 ,在低氧信号转导中起到一个重要的中介作用 ,通过转录水平参与对低氧反应基因的调控 ,从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应。

基于肺胃同治法探讨肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺胃组织PKA、cAMP、SP及TRPV1蛋白表达的影响

目的:观察肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺、胃组织蛋白激酶A(PKA)、环腺苷酸(cAMP)、P物质(SP)表达及磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)表达的影响,探讨肺胃同治法治疗反流性胃肺疾病的作用机制。方法:30只SD大鼠,按随机数字表法分为正常对照组、模型组、中药组、西药组、中西医结合组,每组6只,除正常对照组外均采用慢性食管内灌注盐酸(含蛋白酶)方法建立反流性胃肺黏膜慢性炎症大鼠模型。中药组和西药组从造模第15天开始分别予肃肺和胃汤流浸膏(6.7 g/kg)和雷尼替丁(27 mg/kg)灌胃,中西医结合组同时给予等剂量肃肺和胃汤流浸膏和雷尼替丁,正常对照组及模型组给予同剂量生理盐水,连续灌胃7 d。取肺、胃组织进行病理形态学观察,免疫组化法测定PKA、cAMP、SP表达,用Western Blot检测p-PKA、TRPV1蛋白的表达水平。结果:各给药组大鼠肺、胃组织炎症病理半定量积分较模型组低。与正常对照组比较,模型组大鼠肺、胃组织PKA、cAMP、SP及TRPV1的蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)。与模型组比较,中西医结合组和西药组大鼠肺组织PKA、cAMP、SP蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01),各给药组大鼠胃组织PKA、cAMP和SP蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),各给药组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:肺胃同治法治疗反流性胃肺疾病作用机制可能与通过调控PKA依赖的cAMP信号介导,从而调节TRPV1的激活和SP释放有关。

基于PKA信号通路探讨胆南星对MPTP诱导帕金森病模型小鼠的保护作用

目的 探讨胆南星对帕金森病(PD)模型小鼠的改善作用及可能机制。方法 将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、胆南星低剂量组[0.39 g/(kg·d)]、胆南星高剂量组[1.56 g/(kg·d)]和阳性对照药左旋多巴片组[80 mg/(kg·d)],每组12只。除正常组小鼠注射等体积生理盐水外,其余各组连续5 d腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶[MPTP,35 mg/(kg·d)]建立亚急性PD模型;造模完成后连续给药治疗7 d,于造模前1 d、造模第5天和末次给药后进行爬杆实验和线悬挂测试。采用免疫荧光法检测小鼠脑黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量;采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平以及脑黑质中IL-1β、TNF-α、环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平;采用Western blot法检测小鼠脑黑质中cAMP依赖的蛋白激酶催化亚单位α(PKA C-α)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)以及铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的表达。结果 末次给药后,与正常组比较,模型组小鼠爬杆时间显著延长(P<0.01),线悬挂评分显著降低(P<0.01),脑黑质中TH阳性神经元数量显著减少(P<0.01),血清中IL-1β、TNF-α水平和脑黑质中IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS水平显著升高(P<0.01),脑黑质中GPX4、PKA C-α和FTH1蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,胆南星高剂量组小鼠上述指标水平均显著回调(P<0.05或P<0.01)。结论 胆南星能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动能力障碍,减少脑黑质TH神经元死亡,对模型小鼠具有神经保护作用;这可能与其激活PKA信号通路来抑制神经炎症和神经元细胞铁死亡有关。

针刺对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑神经功能.及5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路的影响机制研究

目的:探讨与研究针刺对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑神经功能及5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路的影响机制。方法:研究时间为2022年6月到2022年12月,SPF级健康雄性SD大鼠36只平分为空白组、模型组、针刺组,每组各12只大鼠。空白组不进行造模,针刺组在造模完成1周后进行针刺治疗,空白组、模型组不进行治疗。结果:所有大鼠都顺利完成实验,无死亡大鼠出现。针刺组、模型组治疗后2周与4周的神经功能评分都显著高于空白组(P<0.05),针刺组的神经功能评分与模型组相比显著降低(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的脑缺氧缺血组织体积都高于空白组(P<0.05),针刺组的脑缺氧缺血组织体积与模型组相比显著降低(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的血清超氧化物歧化酶活力低于空白组(P<0.05),血清丙二醛含量高于空白组(P<0.05),针刺组与模型组对比也有显著差异(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的大脑组织5-HTR1A蛋白、cAMP蛋白、PKA蛋白相对表达水平明显低于空白组(P<0.05),针刺与模型组相比显著提高(P<0.05)。结论:针刺在缺氧缺血性脑损伤大鼠的应用能激活5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路,能提高超氧化物歧化酶活力,降低血清丙二醛含量,能改善大鼠的脑神经功能,降低脑缺氧缺血组织体积。

加味葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织TGR5/cAMP/GLP-1信号通路的影响

目的:探讨加味葛根芩连汤对肥胖型2型糖尿病(T2DM)模型小鼠血糖血脂及胰腺组织中G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)相关途径的影响。方法:将10只7周龄无特定病原体(SPF)级雄性m/m小鼠及50只7周龄SPF级雄性db/db小鼠在SPF级实验室适应性喂养1周。m/m小鼠作为空白组。成模后随机分为5组,每组10只,分别作为模型组、二甲双胍组(0.2 g·kg^(-1))、加味葛根芩连汤高、中、低剂量组(31.9、19.1、6.4 g·kg^(-1)),灌胃体积均为10 mL·kg^(-1),模型组和空白组灌服等体积蒸馏水,1次/d,连续12周。定期检测小鼠空腹血糖(FBG)。药物干预12周后,检测血清中糖化血清蛋白(GSP)、血清葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠胰腺组织病理改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胰腺组织TGR5、蛋白激酶A(PKA)、磷酸化(p)-PKA、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、p-CREB、前蛋白转化酶1/3(PC1/3)、胰高糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测胰腺组织环磷腺苷(cAMP)的含量。结果:与空白组比较,模型组小鼠胰腺组织出现病理学改变;小鼠FBG、GSP、GLU、TC、TG、LDL-C水平显著增高(P<0.01),HDL-C水平明显降低(P<0.05);胰腺组织中TGR5、p-PKA(Thr197)/PKA、p-CREB(Ser133)/CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);胰腺组织中cAMP的含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,治疗组胰腺组织病变程度减轻;加味葛根芩连汤高剂量组及二甲双胍组均能够明显降低db/db小鼠FBG、GSP、GLU、TC、TG、LDL-C水平(P<0.05,P<0.01),显著增高db/db小鼠HDL-C水平(P<0.01);除加味葛根芩连汤中剂量组GLP-1蛋白外,加味葛根芩连汤高、中剂量组及二甲双胍组TGR5、p-PKA(Thr197)/PKA、p-CREB(Ser133)/CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达水平均有不同程度的增加(P<0.05,P<0.01);加味葛根芩连汤高、中剂量组及二甲双胍组胰腺组织中cAMP的含量明显增高(P<0.05,P<0.01)。结论:加味葛根芩连汤能够改善T2DM模型db/db小鼠的葡萄糖稳态,其机制可能与调控TGR5/cAMP/GLP-1信号通路相关蛋白表达有关。

MC1R c.676A>G与山羊皮肤色素沉积的关系及其对黑色素合成的影响

为探讨山羊MC1R基因c.676A>G突变与山羊皮肤色素沉积的关系,及其对黑色素合成和cAMP信号通路下游色素相关基因表达的影响:一方面采用直接测序法检测酉州乌羊及其杂交后代群体(120个个体)MC1R基因c.676A>G的突变情况,用色差仪测量不同基因型个体的腹部皮肤色度值,分析c.676A>G突变与皮肤色素沉积的关系;另一方面,构建野生型(MC1R c.676A)和突变型(MC1R c.676G)真核表达载体,采用脂质体介导法转染到小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16-F10)中进行过表达,利用酶标仪检测各组细胞黑色素含量的差异,并通过实时荧光定量PCR方法检测各组细胞中cAMP信号通路下游色素相关基因(MITF、TYR、TYRP 1、DCT)的表达差异性。结果显示:酉州乌羊及其杂交后代群体中,c.676A>G位点均以GG基因型占优势,不同基因型群体的皮肤色度值差异不显著(P>0.05)。MC1R突变组(MC1R c.676G)细胞中的黑色素含量极显著(P<0.05)高于MC1R野生组(MC1R c.676A)。MITF、TYRP 1和DCT基因在MC1R突变组中的相对表达量极显著(P<0.01)高于野生组,TYR基因在MC1R突变组细胞中的相对表达量显著(P<0.05)高于野生组。综上,MC1R基因c.676A>G不直接影响山羊皮肤色素沉积,但MC1R c.676G能促进B16-F10细胞中黑色素的合成,也能促进cAMP信号通路下游MITF、TYR、TYRP 1和DCT等基因的表达,推测MC1R基因c.676A>G与黑色素合成密切相关。

机械拉伸对人角膜基质细胞水通道蛋白AQP1表达的影响

通过探讨机械拉伸对人角膜基质细胞中水通道蛋白1(AQP1)及下游信号通路相关基因表达的影响,为揭示圆锥角膜等术后并发症的发生机制提供参考。采用FLEX-4000对人角膜基质细胞进行周期性机械拉伸处理,采用Fluo-3荧光探针检测细胞内Ca^2+的浓度,ELISA法检测拉伸处理后胞内cAMP的含量,Real-time PCR分析拉伸和Ca^2+螯合剂BAPTA处理后AQP1及其下游信号通路相关基因的表达变化。结果发现:机械拉伸可诱导角膜基质细胞中AQP1及其下游FAK、Wnt通路相关基因的表达。机械拉伸处理后胞内Ca^2+、cAMP含量显著上升。BAPTA能够抑制拉伸诱导的AQP1及下游ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表达。结果提示机械拉伸能够通过调节胞内Ca^2+浓度和cAMP浓度促进AQP1的表达,并进一步通过下游的FAK、Wnt信号通路诱导MMP2的表达,参与角膜细胞外基质代谢的调节。

白花蛇舌草通过抑制RAP1-JNK信号通路选择性促进人肾癌ACHN细胞间质-上皮转化

目的 :研究白花蛇舌草(Hedyotis di usa Willd,HDW)对人肾癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :人肾细胞腺癌ACHN和人肾近曲小管HK-2细胞经HDW处理24 h后,采用CCK-8法检测HDW对ACHN和HK-2细胞增殖的影响,FCM法检测HDW对细胞周期和凋亡的影响。光学显微镜下及罗丹明染色法观察HDW处理对ACHN和HK-2细胞形态的影响;采用免疫荧光染色法和蛋白质印迹法检测间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)相关蛋白表达的变化。划痕愈合实验和Transwell小室法检测ACHN和HK-2细胞的迁移和侵袭能力,RNA测序法检测HDW对ACHN细胞转录组的影响;实时荧光定量PCR法检测RAP1信号通路相关基因RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phospho-JNK,p-JNK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)表达水平的改变。结果:HDW可选择性抑制ACHN细胞增殖(P <0.01),将细胞周期阻滞于S期(P <0.01),诱导细胞凋亡(P <0.01)。HDW处理后ACHN细胞的形态发生了明显变化,HDW可促进ACHN细胞中E-钙黏蛋白1(E-cadherin 1)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达,并抑制波形蛋白(Vimentin)和Snail1的表达(P值均<0.01)。HDW能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01),且ACHN和HK-2细胞之间没有明显差异。RNA测序结果分析显示,HDW可影响细胞周期相关基因以及控制细胞生长的转录因子E2F和Myc靶基因的表达,并激活p53信号通路;HDW可显著下调ACHN细胞中RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA(P值均<0.000 1)和p-JNK蛋白的表达水平。结论 :HDW可能通过抑制RAP1-JNK信号通路来选择性抑制肾癌细胞ACHN的增殖,促进ACHN细胞MET、周期阻滞和凋亡。

基于小RNA测序和数据库比对探究PRMT1调控的sncRNAs在哮喘中的作用

小非编码RNA(small non-coding RNA,sncRNA)包括microRNA(miRNA)和PIWI蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA,piRNAs),其异常表达参与支气管哮喘(简称哮喘)气道上皮炎症过程。目前的研究多基于哮喘相关sncRNA的异常表达功能研究,少有对sncRNA表达变化原因的探究。我们前期的研究发现,蛋白质精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase 1,PRMT1)作为哮喘标志性分子,参与上皮细胞炎症的发生和气道下重塑。本文利用过表达人肺上皮细胞BEAS-2B中哮喘标志性基因PRMT1,进行sncRNA深度测序并与哮喘数据库联合分析,将差异表达的sncRNA与5个Gene Expression Omnibus(GEO)测序数据集进行比较,发现23种PRMT1调控的哮喘相关的sncRNA。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证,筛选出12种miRNA和2种piRNA。将这些sncRNA靶基因与哮喘病人生成的上皮细胞样本mRNA测序结果(GSE18965和GSE43696)进行交叉比对,初步确定哮喘相关基因,并进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)预测。分析表明,哮喘相关sncRNA主要靶标是Ras/Rap1-MAPK信号通路,包含53种靶基因。本研究通过小RNA测序(small RNA Seq)技术探寻PRMT1调控的下游sncRNA,比对现有的数据库,识别出PRMT1调节的sncRNA及其目标信号通路Ras/Rap1-MAPK,为哮喘的发病机制研究提供了新的sncRNA分子和信号通路靶点。

益气活血方调控cAMP/Epac1/Rap1信号改善冠心病气虚血瘀证大鼠的验证

目的:基于环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷调节鸟嘌呤核苷酸交换因子1(Epac1)/Ras-同源蛋白1(Rap1)信号通路探讨益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠的心肌保护机制。方法:88只SPF级雄性SD大鼠,按随机数字表分为假手术组(n=12)和实验组(n=76),实验组大鼠采用限制饮食及力竭性游泳复合冠状动脉左前降支(LAD)结扎术构建冠心病气虚血瘀证模型,采集大鼠心电图,将造模成功后的实验组大鼠随机分为模型组、益气活血方低、中、高剂量组(4.28、8.55、17.1 g·kg^(-1))、西药组(单硝酸异山梨酯片,3.6 mg·kg^(-1)),连续给药4周;假手术组及模型组灌胃等体积双蒸水。末次给药后24 h取材,行心脏超声检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),左室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF),腹主动脉采血行血液流变学测定,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆cAMP水平;留取心肌组织进行苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察心肌病理损伤情况,透射电镜观察心肌组织超微结构改变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌Epac1、Rap1GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)及Rap1 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌Epac1、Rap1GAP及Rap1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的LVEDD、LVESD显著增加(P<0.01),EF及FS比率显著下降(P<0.01),表现出心功能减退的“心气虚”症状;全血黏度及血浆黏度显著升高(P<0.01),cAMP含量显著升高(P<0.01),心肌组织胶原纤维显著增生(P<0.01),心肌超微结构受损严重,表现出“血瘀”的病理改变;Real-time PCR结果显示模型组大鼠Epac1及Rap1 mRNA显著降低(P<0.01),Rap1GAP mRNA显著增加(P<0.01);Western blot显示Epac1蛋白表达显著降低(P<0.01),Rap1GAP蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,益气活血方能改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度、降低血浆cAMP含量、减少胶原纤维增生,改善心肌超微结构损伤,以高剂量组作用效果最佳。益气活血方高剂量组能显著增加Epac1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),显著增加Rap1 mRNA表达(P<0.01),明显降低Rap1GAP mRNA及Rap1GAP/Rap1蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:益气活血方可改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度与血浆cAMP含量、改善心肌损伤、减少胶原纤维增生,其心肌保护机制可能与调节cAMP/Epac1/Rap1信号通路有关。

松郁安神方对失眠大鼠海马cAMP/PKA信号通路的影响

目的探讨松郁安神方对失眠大鼠海马5-羟色胺1A受体(5-HT1AR)介导的环磷酸腺苷(cAMP)信号通路的影响,明确其作用靶点。方法50只SD大鼠,随机分为对照组、模型组、松郁安神方低剂量组、松郁安神方高剂量组和丁螺环酮组,每组10只。除对照组外,其余4组采用慢性夹尾刺激和腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)建立肝郁失眠大鼠模型。造模成功后,除正常组和模型组外,松郁安神方低剂量组(8.5 g/kg)、松郁安神方高剂量组(17 g/kg)和丁螺环酮组(2.0 mg/kg)按相应剂量灌胃,1次/d,连续14 d。模型组和对照组以等量生理盐水灌胃,频次、时间同前。给药期间,观察大鼠一般状态;给药结束后,观察大鼠体质量、敞箱实验变化,检测各组5-HT1AR及cAMP、蛋白激酶A(PKA)基因和蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组大鼠敞箱实验中央格停留时间、修饰次数、大便颗粒数上升(P<0.05),海马5-HT1AR、cAMP、PKA mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。不同剂量松郁安神方干预后,和模型组相比,松郁安神方高剂量组敞箱实验中央格停留时间、修饰次数、粪便颗粒数均减少,5-HT1AR、cAMP、PKA mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);松郁安神方低剂量组敞箱实验中央格停留时间、修饰次数、粪便颗粒数减少,5-HT1AR、PKA和cAMP mRNA及蛋白表达上调(P<0.05);高剂量组各项指标与丁螺环酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论松郁安神方改善肝郁失眠大鼠睡眠的机制可能是通过海马5-HT1AR介导的cAMP信号通路发挥作用。

右美托咪定预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制

目的观察右美托咪定(Dex)预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响,并探讨其机制是否与氧化应激及Epac1/Rap1信号通路有关。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、Dex组、抑制剂组各8只。Dex组在建模前30 min腹腔注射Dex,抑制剂组在建模前30 min及25 min时分别腹腔注射Epac1拮抗剂ESI09及Dex,假手术组、模型组在建模前30 min腹腔注射相同剂量的生理盐水。除假手术组外,各组均通过结扎左冠状动脉建立MIRI模型,假手术组心脏仅穿线而不结扎左冠状动脉。采用苏木精—伊红(HE)染色观察各组心肌组织病理学变化,ELISA法检测大鼠血清心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)及氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),Western blotting法检测大鼠心肌组织Epac1/Rap1信号通路相关蛋白Epac1、Rap1。结果假手术组心肌纤维排列整齐、边缘清晰,未见心肌纤维断裂和细胞间质肿胀;模型组心肌纤维出现断裂,排列紊乱、边界模糊,有明显中性粒细胞浸润,细胞间质肿胀明显;Dex组与抑制剂组心肌纤维断裂、中性粒细胞浸润减少、间质肿胀均减轻。血清CK-MB、LDH模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组;血清MDA模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组,血清SOD假手术组>抑制剂组>Dex组>模型组;心肌组织Epac1、Rap1蛋白表达模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组(P均<0.05)。结论Dex预处理对大鼠MIRI具有抑制作用,其机制可能与激活Epac1/Rap1信号通路减轻心肌组织氧化应激有关。

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。