人参-五味子药对对PCPA失眠大鼠神经递质及cAMP/Epac/Raf1信号通路的作用机制研究

目的通过观察人参-五味子药对对失眠大鼠下丘脑中神经递质及其cAMP/Epac/Raf1信号通路水平的影响,探讨人参-五味子药对对PCPA失眠大鼠的作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、地西泮组、人参-五味子低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只。除空白组外,其余5组连续3 d对大鼠进行腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)复制失眠模型。模型复制成功后,人参-五味子药对低、中、高剂量组给药浓度分别为0.3、0.9、2.7 g/mL,地西泮组给药浓度为0.002 g/mL,模型组、空白组每天生理盐水灌胃,各组每日灌胃2 mL,连续给药14 d。观察记录各组大鼠的行为学变化;采用HE(苏木素-伊红)染色法检测大鼠下丘脑组织病理形态的改变;ELISA(酶联免疫吸附法)测定大鼠下丘脑中甘丙肽(GAL)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、腺苷(Ado)水平;RT-PCR(实时荧光定量聚合酶链式反应)检测大鼠下丘脑中Eapc、Raf1mRNA的表达;IHC(免疫组织化学染色法)检测大鼠下丘脑中cAMP蛋白的含量。结果和空白组相比:模型组大鼠下丘脑病理切片损伤明显;GAL、5-HT、Ado含量显著下降(P<0.05),NE含量显著上升(P<0.05),下丘脑Eapc、Raf1 mRNA表达显著下降(P<0.05),下丘脑cAMP蛋白表达显著下降(P<0.05),差异有统计学意义。与模型组相比:地西泮组、人参-五味子低、中、高剂量组下丘脑病理切片损伤明显改善;地西泮组、人参-五味子中、高剂量组GAL、5-HT、Ado含量显著上升(P<0.05),NE含量显著下降(P<0.05),下丘脑Eapc、Raf1 mRNA表达显著上升(P<0.05),下丘脑cAMP蛋白表达显著上升(P<0.05),差异有统计学意义。结论人参-五味子药对可能通过上调cAMP/Epac/Raf1信号通路,缓解PCPA大鼠失眠症状。

优化新生脉散方调控β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的 基于β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组10只和手术组40只,采用左冠状动脉前降支结扎法建立心力衰竭大鼠模型。将成模大鼠随机分为模型组、卡托普利组和中药低、高剂量组,每组8只,给药组分别予相应药物灌胃4周。超声心动图测定大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS),测定心、肺质量并计算心、肺脏器系数,组织病理学观察心肌纤维化程度,ELISA测定血清N端脑利钠肽前体(NT-ProBNP)及心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)含量,免疫组化检测心肌组织β1肾上腺素受体(β1-AR)、cAMP阳性表达,Western blot检测心肌组织β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低(P<0.01),心、肺脏器系数明显升高(P<0.01);心肌细胞数目减少、胶原容积分数升高、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比增加(P<0.01),血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量明显升高,心肌组织cAMP含量明显降低(P<0.01),心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达明显降低(P<0.01),β1-AR、腺苷酸环化酶(AC)1、cAMP、p-蛋白激酶A(PKA)、p-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达明显降低,p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,给药组不同程度增加大鼠LVEF、LVFS,降低心、肺脏器系数;增加心肌细胞数目、减少胶原容积分数和Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比,下调血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量,上调cAMP含量,增加心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达,上调β1-AR、AC1、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达,抑制p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达,其中中药高剂量组和卡托普利组作用更明显(P<0.01,P<0.05)。结论 优化新生脉散方能减轻心力衰竭大鼠心肌纤维化程度,改善心肌肥厚和重构,增加左心室收缩力,其机制可能与激活β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1信号通路在脑缺血-再灌注损伤发病机制中的研究进展

脑缺血-再灌注损伤(CIRI)是缺血性卒中患者恢复患侧脑组织血流时引发的严重并发症。CIRI患者常伴有神经功能减退、认知障碍、情绪障碍等,对日常生活产生严重影响。目前CIRI易被早期诊断,但相关特异性治疗方法相对较少。作者对环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1(Epac1/Rap1)信号通路与CIRI的相关性研究进行综述,以期为CIRI患者的临床治疗提供新思路。

基于神经递质和5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路研究黄连温胆汤对失眠大鼠的治疗作用及机制

目的研究黄连温胆汤对失眠大鼠的行为学指标、神经递质水平及5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路的影响,探讨其对失眠大鼠的治疗作用及机制。方法将SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地西泮组(2 mg·kg^(-1))及黄连温胆汤低、高剂量组(5.85、11.70 g·kg^(-1))。黄连温胆汤低、高剂量组模型复制前给予相应剂量的黄连温胆汤进行预防性治疗8 d。除正常组外,其余各组腹腔注射对氯苯丙氨酸(DL-4-Chlorophenylalanine,PCPA)复制失眠模型,成模后给予相应剂量药物干预治疗8 d。观察大鼠每日状态,监测体质量,进行旷场实验(行为学监测)并称取全脑质量计算全脑系数。ELISA法检测血清中脑源性神经营养因子(BDNF)及神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量,脑干中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、γ氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量,下丘脑中5-羟色胺(5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)及环一磷酸腺苷(cAMP)含量。Western Blot法检测下丘脑中5-HT_(1A)受体蛋白和Gα(i)蛋白表达水平。结果①与正常组比较,模型组大鼠活动总距离、总时间均明显增加(P<0.01),中心区域持续时间明显减少(P<0.01);全脑系数明显降低(P<0.01);血清中BDNF含量明显降低(P<0.01),GFAP含量明显升高(P<0.01);脑干中NE、DA、Glu及Glu/GABA水平均明显升高(P<0.01),GABA水平明显降低(P<0.01);下丘脑中5-HT、5-HIAA及cAMP水平均明显降低(P<0.01),5-HT_(1A)受体蛋白表达水平明显下调(P<0.01),Gα(i)蛋白表达水平明显上调(P<0.01)。②与模型组比较,黄连温胆汤各剂量组大鼠活动总距离、总时间均明显减少(P<0.01),高剂量组大鼠中心区域持续时间明显增加(P<0.01);高剂量组大鼠全脑系数明显升高(P<0.01);各剂量组大鼠血清中BDNF含量明显升高(P<0.01),GFAP含量明显降低(P<0.01);各剂量组大鼠脑干中DA及Glu/GABA水平明显降低(P<0.05,P<0.01),高剂量组的NE及Glu水平明显降低(P<0.01)而GABA水平均明显升高(P<0.01);各剂量组大鼠下丘脑中5-HT、5-HIAA、cAMP水平均明显升高(P<0.01),5-HT_(1A)受体蛋白表达水平上调(P<0.05),Gα(i)蛋白表达水平下调(P<0.05,P<0.01)。结论黄连温胆汤可改善大鼠行为学指标,可能通过调控5-HT等神经递质及5-HT_(1A)/Gα_(i/o)/cAMP信号通路相关的蛋白表达,从而改善大鼠失眠症状,减轻大鼠焦虑及躁狂的状态,激发大鼠自发活动和空间探索能力。

参榆洗液改善痔术后大鼠痛觉敏化及对cAMP/PKA信号通路的影响

目的:基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A(c AMP/PKA)信号通路探究参榆洗液对痔术后大鼠疼痛的影响。方法:构建痔术后大鼠模型,将造模成功的56只SD大鼠随机分为模型组、溶剂模型组、参榆洗液组、参榆洗液+Forskolin(c AMP/PKA信号通路激动剂)组、Forskolin组、H-89(c AMP/PKA信号通路抑制剂)组、NS-398(PGE_(2)抑制剂)组,每组8只;另取8只大鼠为空白组。各组大鼠给予对应药物干预,连续7 d。给药结束后1 d,观察大鼠一般状态及疼痛相关动物学行为,观察创面变化并计算创面愈合率,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠创面组织病理学改变,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测各组大鼠背根神经节TRPV1、p-PKA蛋白表达及创面组织中c AMP、PKA蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠创面组织中c AMP m RNA、PKA m RNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测创面组织中PGE_(2)、IL-6、IL-1β含量。结果:模型组大鼠背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面周围组织c AMP、PKA、PGE_(2)、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、IL-1β表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,H-89组、NS-398组、参榆洗液+Forskolin组、参榆洗液组创面组织病变程度减轻,创面愈合率依次上升,背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面组织c AMP、PKA、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、PGE_(2)、IL-1β表达水平依次降低(P<0.05);Forskolin干预能显著提高痔术后大鼠模型c AMP、PKA、TRPV1、p-PKA、PGE_(2)、IL-6、IL-1β表达水平(P<0.05),与参榆洗液联合干预后,上述蛋白及炎症因子表达水平显著下降(P<0.05)。结论:参榆洗液对痔术后大鼠cAMP/PKA信号通路有抑制作用,抑制c AMP/PKA信号通路可改善痔术后痛觉敏化,其机制可能与抑制PGE_(2)表达、减少炎症因子释放、抑制TRPV1活化有关。

circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬

背景:自噬可能参与激素性股骨头坏死的病理过程。有研究证实环状RNA(circular RNA,circRNA)在激素性股骨头坏死中具有调控机制,然而,circCDR1as是否在激素性股骨头坏死中影响自噬尚未被研究。目的:探讨激素性股骨头坏死中自噬水平及circCDR1as的调控机制。方法:①从GSE26316数据集中获取激素性股骨头坏死及对照组大鼠的基因表达谱并进行差异表达分析,随后分析差异表达基因的生物学功能。通过数据库预测circCDR1as的靶标miRNAs及靶标基因。比较靶标基因与差异表达基因,构建circCDR1as的调控网络。②收集激素性股骨头坏死患者及健康对照人群的股骨头样本;同时应用骨髓间充质干细胞进行细胞实验:随机分为骨髓间充质干细胞组、模型组(甲泼尼龙处理)、模型+si-NC组、模型+si-CDR1as组。利用RT-qPCR检测组织和细胞circCDR1as及靶标基因的表达,Western blot检测自噬相关蛋白的表达。③构建荧光素酶报告基因载体:pmirGLO-CDR1as(WT)、pmirGLO-RAF1(WT)、pmirGLO-CDR1as(MUT)和pmirGLO-RAF1(MUT),转染到细胞中,并设miR-7-5p mimic和mimic NC组,检测circCDR1as网络的靶向调控关系。结果与结论:①大鼠激素性股骨头坏死组与对照组之间鉴定了1283个差异表达基因,主要参与细胞凋亡和自噬信号通路。预测发现circCDR1as靶向调控6个miRNAs,这些miRNAs靶向调控305个靶标基因,其中有31个靶标基因在激素性股骨头坏死中差异表达,RAF1参与自噬被选择为关键基因,并构建了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1的调控网络。②与对照组比较,circCDR1as,RAF1和自噬水平在激素性股骨头坏死患者及激素诱导的骨髓间充质干细胞中表达上调(P<0.05),miR-7-5p表达下调(P<0.05);敲降circCDR1as后细胞自噬水平显著下降(P<0.05)。③双荧光素酶报告检测证实了circCDR1as与miR-7-5p以及miR-7-5p与RAF1的靶向调控关系。④结论:CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1可能通过自噬信号促进激素性股骨头坏死,靶向circCDR1as是通过部分自噬修复治疗激素性股骨头坏死的潜在策略。

转染LKB1基因乳腺癌细胞与胚胎发育信号通路及cAMP/PKA通路的关系

目的探讨抑癌基因LKB1与胚胎发育(Sonic Hedgehog,SHH)信号通路、cAMP/PKA信号通路之间的相互关系。方法抑癌基因LKB1转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,分MDA-MB-231组(231组)和转染LKB1基因的MDA-MB-231(LKB1组)两组,每组分别采用0、5×10-6、1×10-5、2×10-5 mol/L等4种浓度的SHH信号通路抑制剂环靶明(cyclopamine)作用于细胞,各小组细胞分别用RT-PCR法和Western blot法检测SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA表达水平和蛋白表达水平,用cAMP、PKA试剂盒检测cAMP、PKA数值水平。结果 LKB1组的细胞通过不同剂量环靶明抑制后,SHH信号通路相关基因SHH、Smo的mRNA和蛋白表达水平相应较231组明显抑制,且与环靶明剂量呈正相关,抑制效果在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时最明显,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,抑制效果保持不变。231组和LKB1组中细胞的PKA和cAMP数值均随环靶明浓度增加而增高,至10×10-6 mol/L时达到最高,继续增加环靶明浓度到20×10-6 mol/L,两组中的PKA和cAMP数值保持不变。在相同环靶明浓度下,LKB1组中PKA和cAMP数值高于231组中相应数值。结论抑癌基因LKB1协同环靶明抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的SHH信号通路的同时亦协同增加cAMP/PKA信号通路的表达,且在环靶明浓度为10×10-6 mol/L时效果最明显;推测存在LKB1-SHH-cAMP/PKA通路。

miR-146b-3p通过RAF1/p38MAPK/COX-2信号通路影响糖尿病发生脑梗死的机制研究

目的探讨miR-146b-3p通过RAF1/p38MAPK/环氧化酶-2(COX-2)信号通路影响糖尿病脑梗死的发生机制。方法选取我院2015年4月—2017年12月210例糖尿病病人为研究对象,通过随访研究调查病人发生血栓情况,有15例患有脑梗死,作为伴有糖尿病的脑梗死(DMCI)组,另选取15例无脑梗死病人为对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组病人白介素-6(IL-6)、COX-2含量;采用聚合酶链式反应(PCR)及免疫印迹方法检测相关基因的mRNA及蛋白表达。结果两组一般资料及相关指标比较差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,DMCI组血中IL-6和COX-2表达升高,但存在一定的局限性;IL-6诱导外周血单核细胞2 h后,COX-2的mRNA和蛋白表达明显增加,COX-2表达受IL-6调控;与对照组相比,miR-146b-3p mRNA在DMCI组表达低于正常组(0.16±0.07与1.12±0.16,P<0.001);与对照组相比,DMCI组RAF1 mRNA的表达增加(P<0.01),且其蛋白表达也增加;DMCI组中COX-2、p-p38MAPK表达增加,p38MAPK蛋白表达减少,说明DMCI病人激活了p38MAPK的信号通路;当用10 ng/mL的IL-6处理外周血单核细胞(PBMC)时,可激活STAT3磷酸化,且当IL-6处理PBMC 1 h后,miR-146b-3p mRNA表达下降,当IL-6处理12 h后,发现miR-146b-3p mRNA在IL-6处理12 h时(0.20±0.12)表达低于对照组(1.02±0.15,P<0.05),还发现IL-6处理中COX-2的mRNA(4.98±0.69)和蛋白质表达高于对照组;DMCI组中miR-146a mRNA表达降低,与miR-146b的表达趋势一致。结论miR-146b-3p的表达通过介导RAF/p38MAPK/COX-2信号通路与糖尿病病人脑梗死的发展密切相关,miR-146b-3p可作为糖尿病脑梗死病人检测和干预的新靶点。

RAF1与SWH信号通路的关系及其在头颈部鳞癌中的作用

SWH信号通路是在果蝇与脊椎动物之间共同存在的保守信号通路。SWH信号通路在果蝇与脊椎动物的器官发育中起一定的作用。在哺乳动物细胞中,维持生理平衡的过程中的压力信号激发STK3。当STK3被过度表达时会引起细胞凋亡。RAF1有抑制STK3的作用。通过RNAseq和微阵列的实验数据可以看出RAF1与TP73在头颈部鳞癌中的关系,可以看出RAF1与SWH信号通路的关系在头颈部鳞癌中可能的作用。

虎杖苷调节cAMP/EPAC1/RAP1信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨虎杖苷调节环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷结合蛋白1(EPAC1)/Ras相关蛋白1(RAP1)信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 研究时间为2022年8月-2023年8月。以子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,分为空白组、虎杖苷-L组(25μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-M组(50μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-H组(100μmol/L虎杖苷)、Forskolin组(cAMP激活剂,100μmol/L Forskolin)以及虎杖苷-H+Forskolin组(100μmol/L虎杖苷+100μmol/L Forskolin)。分别以克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、TUNEL法、CCK-8法、Western Blot检测细胞克隆数、侵袭、迁移、凋亡、增殖及EPAC1、RAP1、凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达。采用ELISA法检测细胞培养基中cAMP水平。结果 与空白组相比,Forskolin组细胞克隆数[(195.66±19.62)个]、侵袭数[(281.52±28.22)个]、迁移率[(82.61±8.31)%]、增殖率[(125.64±12.59)%]、cAMP水平[(1 385.54±138.56)pmol/ml]、EPAC1(1.56±0.16)、RAP1(2.11±0.22)、MMP-9(1.88±0.19)表达显著增加,凋亡率[(5.47±0.56)%]、Cleaved Caspase-3(0.26±0.03)表达均降低(均P<0.05),虎杖苷-L组、虎杖苷-M组、虎杖苷-H组细胞克隆数[(105.34±10.57)个、(65.34±6.58)个、(42.27±4.25)个]、侵袭数[(185.72±18.66)个、(145.47±14.58)个、(112.59±11.29)个]、迁移率[(40.21±4.06)%、(31.12±3.12)%、(21.34±2.15)%]、增殖率[(68.37±6.86)%、(48.67±4.88)%、(35.24±3.55)%]、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达显著降低,凋亡率[(19.85±1.99)%、(27.34±2.77)%、(36.44±3.66)%]、Cleaved Caspase-3表达均增加(均P<0.05)。与Forskolin组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、增殖率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著降低,凋亡率、Cleaved Caspase-3表达均显著增加(均P<0.05)。与虎杖苷-H组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著增加,凋亡率、增殖率、Cleaved Caspase-3表达均显著降低(均P<0.05)。结论 虎杖苷可抑制子宫内膜癌细胞恶性生物学行为发展,可能与抑制cAMP/EPAC1/RAP1信号通路有关。

cAMP/Epac信号通路在当归治疗阴虚证慢性咳嗽中的作用

目的:研究当归对阴虚证慢性咳嗽小鼠的治疗作用,以及对环磷酸腺苷(cAMP)/cAMP直接激活的交换蛋白分子(Epac)信号通路的影响。方法:将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组及当归组(n=8),采用烟熏(每日1次,30 d)、内毒素滴鼻(0.4 mg/ml,每次10μl,持续10次)、灌胃甲状腺(120 mg/kg,每日1次,持续15 d)并吸入氨水(每次3 min,持续10次)来复制阴虚证高反应性气道慢性感染咳嗽小鼠模型。在观察进食饮水、体重及自主活动的基础上,检测当归止咳对支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子、脑组织5-HT、肺组织相关活性因子(SP、PGP9.5、cAMP、Epac1)的影响。结果:与模型对照组比较,当归组小鼠咳嗽次数明显减少,小支气管病理学变化明显缓解,BALF中IL-4、IL-13、TNF-α的含量明显降低,肺组织SP、PGP9.5以及cAMP、Epac1及其基因表达水平明显下调,脑组织5-HT的含量明显提高,同时可缓解饮水及进食量增加、自主活动增加等阴虚证表征指标(P<0.05,P<0.01)。结论:当归具有一定的止咳作用,下调cAMP/Epac信号通路而缓解气道神经源性炎症、抑制咳嗽神经通路增敏是其作用机制之一。

基于肉瘤基因信号通路探讨槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制

目的:探讨槲皮素通过RAS/RAF/MEK1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制。方法:将乳腺癌MCF-7细胞分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组,采用CCK-8细胞活力检测法测定不同组别的MCF-7细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性;采用流式细胞术检测不同组别MCF-7细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测不同组别MEK1、RAS、YAP蛋白的表达;采用免疫荧光染色观察雌激素受体、孕激素受体染色情况。结果:与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞活力均出现下降,呈浓度依赖,不具有时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌细胞MCF-7的晚期凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组和极高剂量组MCF-7细胞的MEK1、RAS、YAP蛋白的表达出现不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞中雌激素受体、孕激素受体表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:槲皮素具有针对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用,且具有浓度依赖性,其机制可能与对RAS/RAF/MEK1信号通路的抑制有关。

缺氧诱导因子-1信号转导通路的研究进展

缺氧诱导因子 1(HIF 1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子 ,在低氧信号转导中起到一个重要的中介作用 ,通过转录水平参与对低氧反应基因的调控 ,从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应。

基于PKA信号通路探讨胆南星对MPTP诱导帕金森病模型小鼠的保护作用

目的 探讨胆南星对帕金森病(PD)模型小鼠的改善作用及可能机制。方法 将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、胆南星低剂量组[0.39 g/(kg·d)]、胆南星高剂量组[1.56 g/(kg·d)]和阳性对照药左旋多巴片组[80 mg/(kg·d)],每组12只。除正常组小鼠注射等体积生理盐水外,其余各组连续5 d腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶[MPTP,35 mg/(kg·d)]建立亚急性PD模型;造模完成后连续给药治疗7 d,于造模前1 d、造模第5天和末次给药后进行爬杆实验和线悬挂测试。采用免疫荧光法检测小鼠脑黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量;采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平以及脑黑质中IL-1β、TNF-α、环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平;采用Western blot法检测小鼠脑黑质中cAMP依赖的蛋白激酶催化亚单位α(PKA C-α)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)以及铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的表达。结果 末次给药后,与正常组比较,模型组小鼠爬杆时间显著延长(P<0.01),线悬挂评分显著降低(P<0.01),脑黑质中TH阳性神经元数量显著减少(P<0.01),血清中IL-1β、TNF-α水平和脑黑质中IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS水平显著升高(P<0.01),脑黑质中GPX4、PKA C-α和FTH1蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,胆南星高剂量组小鼠上述指标水平均显著回调(P<0.05或P<0.01)。结论 胆南星能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动能力障碍,减少脑黑质TH神经元死亡,对模型小鼠具有神经保护作用;这可能与其激活PKA信号通路来抑制神经炎症和神经元细胞铁死亡有关。

基于肺胃同治法探讨肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺胃组织PKA、cAMP、SP及TRPV1蛋白表达的影响

目的:观察肃肺和胃汤对反流性胃肺疾病大鼠肺、胃组织蛋白激酶A(PKA)、环腺苷酸(cAMP)、P物质(SP)表达及磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)表达的影响,探讨肺胃同治法治疗反流性胃肺疾病的作用机制。方法:30只SD大鼠,按随机数字表法分为正常对照组、模型组、中药组、西药组、中西医结合组,每组6只,除正常对照组外均采用慢性食管内灌注盐酸(含蛋白酶)方法建立反流性胃肺黏膜慢性炎症大鼠模型。中药组和西药组从造模第15天开始分别予肃肺和胃汤流浸膏(6.7 g/kg)和雷尼替丁(27 mg/kg)灌胃,中西医结合组同时给予等剂量肃肺和胃汤流浸膏和雷尼替丁,正常对照组及模型组给予同剂量生理盐水,连续灌胃7 d。取肺、胃组织进行病理形态学观察,免疫组化法测定PKA、cAMP、SP表达,用Western Blot检测p-PKA、TRPV1蛋白的表达水平。结果:各给药组大鼠肺、胃组织炎症病理半定量积分较模型组低。与正常对照组比较,模型组大鼠肺、胃组织PKA、cAMP、SP及TRPV1的蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)。与模型组比较,中西医结合组和西药组大鼠肺组织PKA、cAMP、SP蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01),各给药组大鼠胃组织PKA、cAMP和SP蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),各给药组大鼠肺、胃组织p-PKA和TRPV1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:肺胃同治法治疗反流性胃肺疾病作用机制可能与通过调控PKA依赖的cAMP信号介导,从而调节TRPV1的激活和SP释放有关。

益气活血方调控cAMP/Epac1/Rap1信号改善冠心病气虚血瘀证大鼠的验证

目的:基于环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷调节鸟嘌呤核苷酸交换因子1(Epac1)/Ras-同源蛋白1(Rap1)信号通路探讨益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠的心肌保护机制。方法:88只SPF级雄性SD大鼠,按随机数字表分为假手术组(n=12)和实验组(n=76),实验组大鼠采用限制饮食及力竭性游泳复合冠状动脉左前降支(LAD)结扎术构建冠心病气虚血瘀证模型,采集大鼠心电图,将造模成功后的实验组大鼠随机分为模型组、益气活血方低、中、高剂量组(4.28、8.55、17.1 g·kg^(-1))、西药组(单硝酸异山梨酯片,3.6 mg·kg^(-1)),连续给药4周;假手术组及模型组灌胃等体积双蒸水。末次给药后24 h取材,行心脏超声检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),左室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF),腹主动脉采血行血液流变学测定,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆cAMP水平;留取心肌组织进行苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察心肌病理损伤情况,透射电镜观察心肌组织超微结构改变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌Epac1、Rap1GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)及Rap1 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌Epac1、Rap1GAP及Rap1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的LVEDD、LVESD显著增加(P<0.01),EF及FS比率显著下降(P<0.01),表现出心功能减退的“心气虚”症状;全血黏度及血浆黏度显著升高(P<0.01),cAMP含量显著升高(P<0.01),心肌组织胶原纤维显著增生(P<0.01),心肌超微结构受损严重,表现出“血瘀”的病理改变;Real-time PCR结果显示模型组大鼠Epac1及Rap1 mRNA显著降低(P<0.01),Rap1GAP mRNA显著增加(P<0.01);Western blot显示Epac1蛋白表达显著降低(P<0.01),Rap1GAP蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,益气活血方能改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度、降低血浆cAMP含量、减少胶原纤维增生,改善心肌超微结构损伤,以高剂量组作用效果最佳。益气活血方高剂量组能显著增加Epac1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),显著增加Rap1 mRNA表达(P<0.01),明显降低Rap1GAP mRNA及Rap1GAP/Rap1蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:益气活血方可改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度与血浆cAMP含量、改善心肌损伤、减少胶原纤维增生,其心肌保护机制可能与调节cAMP/Epac1/Rap1信号通路有关。

PTPIP51、p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的探讨PTPIP51和p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达及对口腔鳞癌侵袭、转移的影响。方法收集32例口腔鳞状细胞癌及其配对癌旁正常口腔黏膜组织。用免疫荧光组织化学染色激光共聚焦显微镜检测PTPIP51与p-Raf-1蛋白在组织切片内表达及定位;PBS冲洗后对标本进行苏木精-伊红染色,普通光镜对比观察组织结构及细胞形态,同时用免疫组织化学方法(SP法)检测PTPIP51蛋白在组织和细胞内的定位;Rea-ltime PCR检测PT-PIP51与ERK1/2基因mRNA在肿瘤组织及癌旁正常口腔黏膜组织的表达情况。结果 PTPIP51与p-Raf-1蛋白在癌巢周围增殖旺盛的肿瘤细胞、间质免疫细胞及部分脉管壁内皮细胞表达阳性且2种蛋白在细胞中共定位表达。同时发现PTPIP51与ERK1/2基因mRNA在口腔鳞癌组织表达高于配对癌旁正常口腔黏膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05);ERK1/2及PTPIP51基因mRNA表达呈正相关(r=0.641,P<0.05);两者的表达水平与患者的性别、年龄,病理分级无关,与肿瘤的TNM分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 PTPIP51与Raf-1可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程,且2种蛋白与肿瘤的侵袭、转移有密切关系。

针刺对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑神经功能.及5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路的影响机制研究

目的:探讨与研究针刺对缺氧缺血性脑损伤大鼠脑神经功能及5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路的影响机制。方法:研究时间为2022年6月到2022年12月,SPF级健康雄性SD大鼠36只平分为空白组、模型组、针刺组,每组各12只大鼠。空白组不进行造模,针刺组在造模完成1周后进行针刺治疗,空白组、模型组不进行治疗。结果:所有大鼠都顺利完成实验,无死亡大鼠出现。针刺组、模型组治疗后2周与4周的神经功能评分都显著高于空白组(P<0.05),针刺组的神经功能评分与模型组相比显著降低(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的脑缺氧缺血组织体积都高于空白组(P<0.05),针刺组的脑缺氧缺血组织体积与模型组相比显著降低(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的血清超氧化物歧化酶活力低于空白组(P<0.05),血清丙二醛含量高于空白组(P<0.05),针刺组与模型组对比也有显著差异(P<0.05)。针刺组、模型组治疗后2周与4周的大脑组织5-HTR1A蛋白、cAMP蛋白、PKA蛋白相对表达水平明显低于空白组(P<0.05),针刺与模型组相比显著提高(P<0.05)。结论:针刺在缺氧缺血性脑损伤大鼠的应用能激活5-HTR1A/cAMP/PKA信号通路,能提高超氧化物歧化酶活力,降低血清丙二醛含量,能改善大鼠的脑神经功能,降低脑缺氧缺血组织体积。

FTH1激活RAF/MEK/ERK通路促进肝细胞癌生长

[目的]应用生物信息学和分子生物学手段研究铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中的功能和分子机制。[方法]通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)、TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)、TNMplot和GEPIA2(Gene Expression Omnibus)等公开数据库的数据进行分析FTH1在肝癌中的表达量和预后生存期,同时应用分子生物学实验在肝癌细胞系中分析FTH1的作用机制。[结果]在肝癌组织中FTH1的表达量高于正常(P<0.01),同时FTH1高表达的HCC患者预后更差(P<0.01)。蛋白免疫印迹分析和荧光定量PCR细胞实验表明,与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞系HepG2和Huh7中FTH1的mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.01)。MTT和细胞克隆形成实验结果表明FTH1敲低的HepG2和Huh7细胞增殖能力降低40%~50%。进一步蛋白免疫印迹结果显示FTH1敲低的细胞中RAF、MEK和ERK的磷酸化水平明显降低(P<0.05)。[结论] FTH1可通过激活RAF/MEK/ERK信号通路促进HCC细胞的生长。

加味葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织TGR5/cAMP/GLP-1信号通路的影响

目的:探讨加味葛根芩连汤对肥胖型2型糖尿病(T2DM)模型小鼠血糖血脂及胰腺组织中G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)相关途径的影响。方法:将10只7周龄无特定病原体(SPF)级雄性m/m小鼠及50只7周龄SPF级雄性db/db小鼠在SPF级实验室适应性喂养1周。m/m小鼠作为空白组。成模后随机分为5组,每组10只,分别作为模型组、二甲双胍组(0.2 g·kg^(-1))、加味葛根芩连汤高、中、低剂量组(31.9、19.1、6.4 g·kg^(-1)),灌胃体积均为10 mL·kg^(-1),模型组和空白组灌服等体积蒸馏水,1次/d,连续12周。定期检测小鼠空腹血糖(FBG)。药物干预12周后,检测血清中糖化血清蛋白(GSP)、血清葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠胰腺组织病理改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胰腺组织TGR5、蛋白激酶A(PKA)、磷酸化(p)-PKA、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、p-CREB、前蛋白转化酶1/3(PC1/3)、胰高糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测胰腺组织环磷腺苷(cAMP)的含量。结果:与空白组比较,模型组小鼠胰腺组织出现病理学改变;小鼠FBG、GSP、GLU、TC、TG、LDL-C水平显著增高(P<0.01),HDL-C水平明显降低(P<0.05);胰腺组织中TGR5、p-PKA(Thr197)/PKA、p-CREB(Ser133)/CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);胰腺组织中cAMP的含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,治疗组胰腺组织病变程度减轻;加味葛根芩连汤高剂量组及二甲双胍组均能够明显降低db/db小鼠FBG、GSP、GLU、TC、TG、LDL-C水平(P<0.05,P<0.01),显著增高db/db小鼠HDL-C水平(P<0.01);除加味葛根芩连汤中剂量组GLP-1蛋白外,加味葛根芩连汤高、中剂量组及二甲双胍组TGR5、p-PKA(Thr197)/PKA、p-CREB(Ser133)/CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达水平均有不同程度的增加(P<0.05,P<0.01);加味葛根芩连汤高、中剂量组及二甲双胍组胰腺组织中cAMP的含量明显增高(P<0.05,P<0.01)。结论:加味葛根芩连汤能够改善T2DM模型db/db小鼠的葡萄糖稳态,其机制可能与调控TGR5/cAMP/GLP-1信号通路相关蛋白表达有关。