cAMP受体蛋白在细菌中的转录调控作用研究进展

细菌中cAMP受体蛋白(CRP)对依赖其的启动子的转录起始调控机制及其他调控作用已经得到详细深入的研究。CRP由cAMP激活,并与之结合形成CRP-cAMP复合体,后者与启动子上的特异位点结合,然后与RNA聚合酶相互作用,增强其与启动子的结合能力,从而起始转录。CRP-cAMP复合体与启动子不同的结合方式决定了CRP与RNA聚合酶之间存在多种不同的作用方式。除了在碳源代谢方面的重要调控作用,CRP对细菌其他代谢途径也有调控作用。

肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其在生物膜形成中的作用

目的构建肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因(crp基因)缺失突变株与回补株,了解crp基因在肺炎克雷伯菌生物膜形成中的作用。方法设计位于crp基因(566 bp)上游698 bp片段及下游576 bp片段的两对引物,分别扩增出相应片段并通过融合PCR构建一个1 274 bp片段的突变盒,利用双酶切克隆的方法将突变盒克隆至温度敏感性自杀载体pKO3-Km的NotⅠ位点间,电转化至肺炎克雷伯菌中构建肺炎克雷伯菌crp基因无痕缺失突变株(Δcrp)。扩增包含crp基因编码、启动子结合区及转录终止区的2 063 bp基因片段并克隆至pGEM-T-easy质粒上,将此质粒电转至crp基因缺失突变株中构建crp基因回补株(C-crp)。采用RT-PCR方法检测crp基因在基因缺失株与回补株的表达情况,确定crp基因缺失突变株与回补株构建成功。利用结晶紫染色法检测crp基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响,并通过酵母凝集试验检测crp基因对肺炎克雷伯菌的菌毛形成影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌crp基因缺失突变株与回补株,RT-PCR结果显示,crp基因在缺失突变株中无表达,在回补株重新表达。体外试管静止培养48 h后,crp基因缺失株无明显生物膜形成,而在野生株及回补株的液体培养基表面形成宽厚生物膜。结晶紫染色定量发现,crp缺失突变株的生物膜相对形成量显著低于野生株(0.063±0.011 vs 1.020±0.056,P<0.001)。酵母凝集试验发现在crp基因缺失突变株中细菌菌毛生成能力下降,提示crp基因影响肺炎克雷伯菌菌毛的生成。结论肺炎克雷伯菌crp基因可能通过调控肺炎克雷伯菌菌毛生成而正调控细菌生物膜的形成。

cAMP受体蛋白对铁载体相关毒力基因的调控

铁作为大多数生物体必须的微量元素,是执行关键反应的各种酶的重要辅因子,铁载体已被认为是重要的毒力因子。cAMP受体蛋白是一个整体调控子,直接或间接参与了某些原核生物以及真核生物铁载体相关基因的调控。该文简单介绍了cAMP受体蛋白,并就cAMP受体蛋白对肺炎克雷伯菌、鼠疫耶尔森菌、创伤弧菌及新型隐球菌等菌种铁载体相关毒力基因的调控进行综述,以期为明确cAMP受体蛋白对铁载体的调控机制打下理论基础,并为致病菌毒力控制及临床防治提供参考。

cAMP受体蛋白对嗜水气单胞菌生长初期胆汁耐受性的影响

目的本研究拟确定cAMP受体蛋白对嗜水气单胞菌胆汁耐受性的影响。方法构建嗜水气单胞菌的luxS、crp的缺失株及crp回补株,通过胆汁生长实验确定嗜水气单胞菌及其构建株的胆汁耐受性。结果嗜水气单胞菌BJ018、BJ018ΔluxS和BJ018Δcrp在LB培养基中生长速度基本一致。10%胆汁LB中,BJ018和缺失株ΔluxS前8 h生长被抑制,后期呈对数快速生长;其缺失株Δcrp生长速度领先于野生株,早期生长未被抑制。嗜水气单胞菌BJ018Δcrp的回补株早期生长重新被抑制,与野生株BJ018基本一致。其他两株嗜水气单胞菌BJ017、BJ054及其缺失株Δcrp胆汁生长结果与BJ018、BJ018Δcrp一致。这些结果提示嗜水气单胞菌CRP影响菌株对胆汁的耐受。结论CRP的存在影响嗜水气单胞菌在胆汁中的生长,可能在胆汁耐受调控中起到重要作用。

肺炎克雷伯菌转录调控子CRP对菌株粘附能力及细胞活性的影响

目的分析肺炎克雷伯菌临床分离株WT(wild type)、回补株(c-Δcrp)和突变株(Δcrp)对人肺癌上皮细胞A549细胞的粘附能力及细胞活性的影响。方法肺炎克雷伯菌WT株、c-Δcrp株和Δcrp株感染人肺癌上皮细胞A549,经裂解液裂解后平板计数计算粘附的菌量。LDH释放法检测细菌对细胞的毒性,优化感染时间和感染指数。结果 WT株及c-Δcrp株粘附的菌量分别为logCFU=5.145和logCFU=4.915,均高于Δcrp株(logCFU=4.122),差异有统计学意义(F=8.366,P=0.004)。以MOI=1 000(细菌∶细胞=1 000)的菌量感染靶细胞,37℃孵育8 h,加底物液避光显色10 min,离心所得上清稀释10倍进行测定为最佳反应条件。WT株对细胞的毒性百分比(70.69%)明显高于Δcrp株(19.54%),差异有统计学意义(t=8.843,P=0.001)。结论 crp基因敲除后,突变株的细胞毒性和粘附力明显下降,肺炎克雷伯菌转录调控子CRP对菌株粘附力及细胞活性具有正向调控作用。

肺炎克雷伯菌crp缺失株生物学特性初步研究

目的:研究cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein,crp)对肺炎克雷伯菌生物学特性的影响。方法:通过细菌生长特性、荚膜染色、超黏性试验和离心试验观察肺炎克雷伯菌crp缺失株体外生物学特性的改变。结果:肺炎克雷伯菌crp缺失株生长菌落较小,生长速度较慢,细菌形态由杆状变为圆形,离心不易沉淀于Ep管底部。结论:crp调控子可能会影响肺炎克雷伯菌的生长、细菌形态和荚膜含量等生物学特性。该研究为肺炎克雷伯菌crp基因功能进一步研究提供了依据。

鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的保护效力评价

目的为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒活疫苗,该实验对鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的安全性及保护力进行观察。方法以1×108集落形成单位的1009ΔspiCΔcrp对3日龄雏鸡口服免疫,在7 d后进行再次免疫,测定雏鸡的体质量变化、血清抗体水平和细胞因子水平,并对SG9强毒株攻毒后的保护力进行评价。结果免疫组鸡的体质量增长与对照组无明显差异,血清IgG水平持续上升并显著高于对照组,白细胞介素4(IL-4)、IL-6和IL-1β的水平也升高。以SG9强毒株攻击后,免疫组的保护率为100%,而对照组为20%。HE染色结果显示,免疫组鸡无病变,而对照组鸡脏器病变明显。结论1009ΔspiCΔcrp具有良好的安全性和免疫原性,是防治鸡伤寒理想的疫苗候选株。

2型猪链球菌SSU05_0736基因敲除株的构建及其特性分析

目的 2型猪链球菌是重要的人畜共患病病原菌,鉴定现有的和发掘新的毒力因子依然是该领域的研究热点。探讨SSU05_0736编码的c AMP受体蛋白在2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)中国强毒株05ZYH33中的作用机制,初步分析SSU05_0736基因敲除株的生物学特性,为进一步研究猪链球菌可能的毒力因子及其致病机制提供研究基础。方法利用同源重组原理构建并筛选由壮观霉素抗性基因(Spcr)替换S.suis 2中SSU05_0736的基因敲除株Δ0736,系统比较分析野毒株与敲除株的生物学特性,同时将BALB/c小鼠作为动物感染模型来探究敲除株的毒力。结果通过组合PCR、反转录PCR(RT-PCR)等方法鉴定并成功构建基因敲除株Δ0736,其在菌落形态、溶血活性及对小鼠致病力等方面与野毒株无显著差异;两者生长速率相比,敲除株的生长较野毒株迟缓但其在对数期增长速率较大。结论 SSU05_0736基因的缺失并未使猪链球菌2型强毒株05ZYH33的毒力发生显著改变,推测SSU05_0736基因并非毒力决定因子,但与野毒株相比敲除株在生长速率尤其对数期增长速率较大这一方面的改变,提示可对其代谢调控能力作进一步分析。

鼠疫菌、副溶血性弧菌及肺炎克雷伯菌CRP蛋白的表达及其DNA结合活性分析

目的表达有活性的鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)、副溶血性弧菌以及肺炎克雷伯菌的cAMP受体蛋白(CRP)并进行DNA体外结合活性分析,为深入研究3种CRP蛋白间的交互转录调控作用奠定基础。方法应用大肠埃希菌pET系统体外表达鼠疫菌201株、副溶血性弧菌5421株以及肺炎克雷伯菌tw518株的CRP蛋白;应用生物信息学对3种CRP蛋白进行同源性比较,并对CRP与靶DNA的结合基序(CRP consensus)进行分析预测;通过体外凝胶阻滞实验(EMSA)和DNaseⅠ足迹实验验证His?CRP与DNA的结合活性。结果成功表达出3种菌有活性的His?CRP融合蛋白,3种CRP蛋白对鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因均有结合活性。结论 3种CRP蛋白都能直接结合到鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因的启动子区,说明上述3种CRP蛋白对3种病原菌的重要毒力基因的转录可能具有交互调控作用。

肺炎克雷伯菌基因无痕敲除方法的建立

目的建立可行的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)基因无痕敲除方法。方法 PCR扩增得到目的基因上下游同源臂融合片段,将其克隆到自杀载体pKO3-km,构建重组质粒。提取重组质粒,通过电转化转入肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中,在43℃条件下培养筛选得到重组质粒整合到细菌基因组上的重组子,再利用质粒pKO3-km上的sacB基因在含蔗糖的平板上反向筛选得到突变株。结果与结论成功构建突变株,且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留。该研究为肺炎克雷伯菌基因功能研究提供了基因敲除技术。