cAMP应答元件结合蛋白与痛觉调制

cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element bind ing protein,CREB)是刺激诱导的一种转录因子,通过磷酸化实现调节转录功能。疼痛和痛觉过敏是组织损伤或炎症时常伴有的生理病理过程,谷氨酸、P物质等神经递质或神经肽以及细胞内的信号转导途径参与此过程。近年来研究发现CREB通过自身磷酸化,在炎症、神经损伤等诱发的自发性疼痛、痛觉过敏及痛觉超敏中具有重要作用。本文从CREB的一般特性及其在脊髓水平的痛觉调制中的作用等方面予以综述。

镧对大鼠海马CA3区cAMP应答元件结合蛋白磷酸化和及刻早期基因表达的影响

目的研究镧(La)对大鼠海马CA3区钙调蛋白(CaM)活性、钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(CaMKIV)和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化以及c-fos、c-jun和egr1基因表达的影响。方法 40只成年雌性大鼠随机分成对照组和低、中、高剂量LaCl3染毒组,LaCl3组仔鼠在出生至断乳前通过母乳染毒,断乳后通过自由饮水的方式染毒1个月。采用磷酸二酯酶法检测仔鼠海马CA3区CaM活性,Western blot法检测仔鼠海马CA3区p-CaMK IV和p-CREB蛋白表达水平,RT-PCR法检测仔鼠海马CA3区c-fos、c-jun和egr1mRNA表达水平。结果各LaCl3染毒组海马CA3区CaM活性和p-CaMK IV、p-CREB蛋白表达水平均显著低于对照组,且具有一定的剂量-反应关系。低、中剂量LaCl3染毒组c-fos和c-jun mRNA表达显著低于对照组,中剂量LaCl3染毒组egr1 mRNA表达显著低于对照和低剂量LaCl3染毒组,高剂量LaCl3染毒组c-fos、c-jun和egr1 mRNA表达显著低于对照和低、中剂量LaCl3染毒组。结论镧可通过降低海马CA3区CaM活性和CaMK IV、CREB磷酸化以及c-fos、c-jun和egr1基因转录水平,从而损害大鼠的学习记忆能力。

心肺复苏大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B和磷酸化cAMP应答元件结合蛋白表达的变化及APP17肽的影响

目的探讨心肺复苏后大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，P13K）、蛋白激酶B（protein kirmse B，PKB）、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白（phosphorylation of cAMP response elementb inding protein，p-CREB）表达的变化，以及APP17肽对它们的影响。方法实验地点在宣武医院神经变性病学重点实验室。雄性Wistar大鼠21只，随机分3组，每组7只：假手术对照组（A组）、心肺复苏组（B组）、心肺复苏＋APP17肽组（C组）。自主呼吸循环恢复（return of spontaneous circulation，ROSC）标准为心电图出现正常的QRS波群，心室内压≥60mmHg，持续10min以上；夹闭气管制作大鼠心跳呼吸停止模型，行心肺复苏。当大鼠出现ROSC时，复苏组静脉注射生理盐水；APP17肽组静脉注射APP17肽10μg·（300g）^-1。对照组行假手术，静脉注射生理盐水。维持生命体征至2h，断头取脑，行冰冻切片。应用免疫组化法观察3组大鼠复苏2h后海马神经元P13K，PKB，p-CREB表达情况；三组中各取1只大鼠于ROSC后2h，分离海马；应用Westem-blot方法测定海马神经元PKB，p-CREB蛋白含量。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间数据用方差分析，以P〈0．05为差异具有统计学意义。结果免疫组化法显示：B组P13K阳性细胞表达为（2．75±1．80），略高于A组（2．53±1．53），差异没有统计学意义；而C组为（5．85±2．83），较B组增加，差异具有统计学意义（P〈0．01）。B组PKB和p-CREB阳性细胞分别较A组明显减少[（2．45±1．36）VS．（5．22±2．50），（P〈0．05）；（2．41±1．11）VS．（8．314±3．02），P〈0．01]；C组PKB和p-CREB阳性细胞分别较B组增高[（9．66±4．32）VS．（2．45±1．36），P〈0．01；（14．18±3．96）VS．（2．41±1．11），P〈0．01]。Western-blot法测定PKB，p-CREB蛋白含量B组较A组明显减少；C组较B组明显增加。结论心肺复苏大鼠ROSC2h海马神经元PKB，p-CREB表达降低，APP17肽能恢复神经元P13K，PKB，p-CREB的表达，对心肺复苏后海马神经元损伤有保护作用。

CREB研究进展

CREB是cAMP应答元件结合蛋白 (cAMPresponseelementbindingprotein)的简称 ,它于80年代后期被发现。CREB由 341个氨基酸残基组成 ,分子量 430 0 0。分子结构分两个区域 ,N端区域与调节转录的功能有关 ,C端区域是与启动子结合的部位。CREB是CREB ATF家族中的一个成员 ,它包括 8种分子亚型 ,其中CREBα和CREBΔα最为重要。CREB是一种细胞核内调控因子 ,它通过自身磷酸化实现调节转录的功能。CREB与学习记忆分子神经机制的关系特别受到注意。CREB能促进果蝇和小鼠等动物长时程记忆的形成。开展对CREB在人类大脑记忆活动中功能的研究 ,是分子神经生物学家感兴趣的课题。

微波辐射对大鼠睾丸组织pCREB、CREM及CBP蛋白表达的影响

目的探讨微波辐射对睾丸组织磷酸化环磷酸腺苷(cAMP)-反应元件结合蛋白(pCREB)、cAMP反应元件调节因子(CREM)及CREB结合蛋白(CBP)表达的影响及其意义。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(n=5)和辐射组(n=25)。辐射组接受30mW/cm2微波辐射5min,分别于辐射后6h,1、3、7、14d处死5只大鼠。对照组不接受辐射,于1d时活杀。采用免疫组织化学及Western blotting检测睾丸组织pCREB、CREM及CBP蛋白表达的变化。结果 pCREB、CREM和CBP均主要表达于睾丸生精小管精子细胞核。微波辐射后6h^14d(pCREB在1d时除外),pCREB和CBP蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),辐射后6h^7d CREM表达亦明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论 pCREB、CREM及CBP表达下调在微波辐射致生精细胞损伤中可能发挥重要作用。

咯利普兰对H_2O_2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法以H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型,MTT法检测细胞存活率;碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色流式细胞术检测细胞周期变化;化学比色法测定细胞清除羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2·)的能力;以及培养上清液中的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。Western blot和Real-time RT-PCR检测细胞内硫氧还蛋白(Trx)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。结果咯利普兰能明显提高H2O2损伤的PC12细胞存活率,恢复细胞增殖;提高细胞清除·OH和O2·的能力;降低MDA和NO含量,提高GSH含量和SOD活性;使Trx蛋白和mRNA表达增加,同时下调iNOS蛋白和mRNA表达。结论咯利普兰对H2O2致PC12细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与提高PC12细胞的抗氧化能力相关。

CREB信号通路在神经系统中的调控及功能

cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)在神经元生成、突触可塑性及学习记忆等方面都具有重要的调节作用,这使得与CREB信号通路相关的分子成为较受关注的神经系统疾病干预的药物靶点.本文概述了CREB的基本构成、相关信号通路、其目的基因表达调控及其在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)中的作用.

p38MAPK对肉豆蔻提取物干预的小胶质细胞CREB表达的影响

目的探讨肉豆蔻提取物对鼠性小胶质BV2细胞的调控作用。方法应用WST-8试剂盒和Westernblot技术,观察肉豆蔻提取物对体外培养的鼠性小胶质BV2细胞的生存率及脂多糖(LPS)诱导的p38MAPK、磷酸化p38MAPK和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)表达的影响。结果肉豆蔻提取物对BV2细胞无毒性,且抑制LPS所诱导的磷酸化p38MAPK和CREB的表达。结论肉豆蔻提取物可抑制LPS所诱导的小胶质细胞p38MAPK磷酸化和CREB的表达。

腹腔注射右美托咪啶对神经病理性疼痛大鼠镇痛的实验研究

目的：评价右美托咪啶对神经病理性疼痛大鼠行为学、痛敏及脊髓背角神经元磷酸化胞外反应激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases,pERK）、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element bound protein,pCREB）、c-fos蛋白表达的影响.方法：健康成年雄性Wistar大鼠54只,6～8周龄,体重180～220 g,采用随机数字表法,将其分为3组（n=18）：假手术组（S组）、慢性神经病理性疼痛组（C组）和右美托咪啶组（D组）.S组仅分离坐骨神经但不结扎,C组和D组采用结扎坐骨神经的方法制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constriction injury,CCI）的神经病理性疼痛模型,D组于术后即刻开始至处死前1d腹腔注射右美托咪啶50 μg/kg,1次/d,S组和C组注射等容量生理盐水.于术前1d、术后3、7、14d时以缩足阈值（paw withdrawal threshold,PWT）测定大鼠机械痛阈和辐射热的缩足潜伏期（paw withdrawllatency,PWL）测定大鼠的热痛阈,并于术后测定痛阈后灌注处死大鼠,取L4～6脊髓组织,采用免疫组织化学法检测脊髓背角神经元pERK、pCREB、c-fos的表达水平.结果：与S组比较,C组和D组术后3、7、14 d时MWT降低,TWL缩短,脊髓背角pERK、pCREB、c-fos表达上调（P＜0.05）;与C组比较,D组术后3、7、14 d时MWT升高,TWL延长,脊髓背角pERK、pCREB、c-fos表达下调（P＜0.05）.与术前1d比较,C组和D组术后3、7、14d时MWT降低,TWL缩短;与术后3d时比较,C组和D组7、14d时MWT降低,TWL缩短,脊髓背角pERK、pCREB、c-fos表达上调（P＜0.05）.结论：右美托咪啶可减轻大鼠慢性神经病理性疼痛,抑制pERK、pCREB、c-fos的表达可能是其作用机制之一.

儿童急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液中miR-182-5p上调促进CREB蛋白表达的实验研究

目的从微小RNA(micro RNA)组学角度探索儿童急性横贯性脊髓炎(ATM)发生的分子生物学机制,以期寻找关键治疗靶点。方法使用microarray4.0芯片检测儿童急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液中发生改变的micro RNA,运用生物信息学方法论证发挥关键调控作用的micro RNA,进行靶基因预测。运用反转录荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)技术进行生物学与技术重复。检测关键micro RNA靶蛋白的表达量并分析样本间靶蛋白与目标micro RNA表达变化趋势相关性。结果急性横贯性脊髓炎患儿脑脊液样本中共有247个micro RNA发生表达变化,micro RNA-182-5p(mi R-182-5p)特征性上调明显。生物信息分析结果显示c AMP应答元件结合蛋白(CREB)可为mi R-182-5p的靶基因,与mi R-182-5p趋势相反。结论儿童急性横贯性脊髓炎脑脊液中mi R-182-5p上调导致CREB下调,使神经元轴突生长能力下降。mi R-182-5p是儿童急性横贯性脊髓炎治疗的关键靶点之一。

温肾健脾调枢方对腹泻型肠易激综合征大鼠的治疗作用及机制

目的观察中药温肾健脾调枢方干预对腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)大鼠磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(pCREB)及下游即刻早期基因Arc、c-fos表达的影响。方法将40只Wistar大鼠适应性喂养5 d后,采用随机数字表法分为正常组(NG)、模型组(MG)、中药温肾健脾调枢方高剂量组(ZHG)、中药温肾健脾调枢方中剂量组(ZMG)和中药温肾健脾调枢方低剂量组(ZLG)5组,各8只。MG组、ZHG组、ZMG组和ZLG组均采用番泻叶灌胃法+避水应激实验建立IBS-D大鼠模型,ZHG组、ZMG组、ZLG组按高、中、低剂量给予温肾健脾调枢方灌胃,MG组、NG组给予生理盐水灌胃,1次/d,连续10 d。观察比较各组大鼠一般情况、体质量变化、排便粒数、内脏敏感性和组织病理学,免疫组化检测结肠组织中pCREB、Arc、c-fos表达。结果治疗结束后,ZHG组和ZMG组大鼠体质量高于MG组(P<0.05);ZHG组、ZMG组、ZLG组大鼠1 h内排便粒数低于MG组(P<0.05);ZHG组大鼠腹壁撤退反射(AWR)评分低于MG组(P<0.05);MG组和ZLG组组织病理学观察可见黏膜轻度水肿;ZHG组、ZMG组和ZLG组大鼠结肠组织pCREB表达低于MG组(P<0.05);ZHG组、ZMG组大鼠结肠组织Arc、c-fos表达低于MG组(P<0.05)。结论温肾健脾调枢方能够增加IBS-D大鼠体质量、减少排便粒数、降低内脏敏感性,其作用机制可能是通过调控结肠组织中pCREB、Arc和c-fos的表达实现。

高压氧治疗对急性脑外伤大鼠神经行为学及CREB表达的影响

目的:探讨高压氧治疗对急性脑外伤大鼠神经功能修复及c AMP应答元件结合蛋白(c AMP response element blinding protein,CREB)信号分子表达的影响。方法:选取成年SD大鼠24只,按随机数字表法分为三组,即假手术组、脑外伤组及高压氧治疗组,每组8只。假手术组行开颅手术不致脑外伤,脑外伤组采用自由落体打击法制作中度脑外伤模型(以50 g重的铁质圆柱体自30 cm高处沿铁杆自由落体撞击暴露的大脑右侧运动皮质区),高压氧治疗组在脑外伤模型上行高压氧治疗(1次/d,连续治疗10 d)。各组伤后第10天对大鼠进行神经功能缺损(Neurological Severity Scores,NSS)评分,然后处死大鼠,获取大脑右侧运动皮质区,采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法测定CREB m RNA的表达。结果:大鼠中度脑外伤后出现不同程度的抽搐,瘫痪和平衡功能缺失。NSS评分结果显示:脑外伤组NSS评分(4.50±0.40)分,与假手术组的(0.30±0.10)分比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),高压氧治疗组NSS评分(3.10±0.35)分与脑外伤组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,RT-PCR结果显示:脑外伤组CREB m RNA表达为(0.81±0.02),与假手术组的(0.62±0.01)比较明显升高,而高压氧治疗组(0.72±0.02)较脑外伤组CREB m RNA明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:高压氧治疗能明显改善大鼠神经行为学,其作用机制可能与抑制CREB信号分子的表达有关,从而抑制神经细胞的凋亡。

TORC2:糖尿病治疗的新靶点

胰高血糖素等通过激活受体,使胞内cAMP浓度升高,激活异生或糖原分解与糖相关的基因,从而使血糖浓度升高。此过程由转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB),在其他蛋白质尤其是TORC2辅助下完成的。TORC2磷酸化时处于细胞质,脱去磷酸而进入细胞核才能发挥与CREB的共激活效应。因此,抑制TORC2的脱磷酸或进入细胞核,可以实现减少肝脏中的糖生成,从而可望在糖尿病治疗中发挥作用。

人溶血磷脂酸受体1基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞

从人胃癌细胞中提取RNA然后反转录成cDNA,进而PCR克隆LPAR1(Lysophosphatidic Acid Receptor1)基因,亚克隆到pCR2.1载体,通过测序、酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP,通过酶切、测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染293T细胞。用Real-time PCR法检测外源基因在293T细胞中表达,并通过ELISA检测LPAR1的活性。结果表明,克隆到LPAR1基因并获得了pIRES2-EGFP-LPAR1表达载体,在293T细胞中确认到LPAR1基因的过量表达,并通过LPAR1/Gi信号通路抑制cAMP形成加以验证所克隆LPAR1活性。LPAR1过表达细胞模型的建立,不仅为下一步对该受体功能研究奠定了基础,还使利用LPA剂量依赖性的抑制cAMP的线性关系定量LPA的细胞学方法成为可能。

右美托咪啶对神经病理性痛大鼠脊髓背角pERK、c—fos表达的影响

目的：评价右美托咪啶对神经病理性痛大鼠脊髓背角神经元磷酸化胞外反应激酶（ phosphoryltion of extracellular reg-ulated protein kinases， pERK ）、c－fos蛋白表达的影响。方法：健康成年雄性Wistar大鼠54只，6～8周龄，体重180～220 g，采用随机数字表法，将其分为3组（n＝18）：假手术组（S组）、慢性神经病理性痛组（C组）和右美托咪啶组（D组）。 S组仅分离坐骨神经但不结扎，C组和D组采用结扎坐骨神经的方法制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（ chronic constriction injury， CCI）的神经病理性痛模型，D组于术后即刻开始至处死前1天腹腔注射右美托咪啶50μg／kg，1次／d，S组和C组注射等容量生理盐水。于术前1天、术后3、7、14天时以缩足阈值（ paw withdrawal threshold， PWT）测定大鼠机械痛阈和辐射热的缩足潜伏期（ paw withdrawl latency， PWL）测定大鼠的热痛阈，并于术后测定痛阈后灌注处死大鼠，取L4～6脊髓组织，采用免疫组织化学法检测脊髓背角神经元pERK、c－fos的表达水平。结果：与S组比较，C组和D组术后3、7、14天时MWT降低，TWL缩短，脊髓背角pERK、c－fos表达上调（P＜0．05）；与C组比较，D组术后3、7、14天时MWT升高，TWL延长，脊髓背角pERK、c－fos表达下调（P＜0．05）。与术前1天比较，C组和D组术后3、7、14天时MWT降低，TWL缩短；与术后3天时比较，C组和D组7、14天时MWT降低，TWL缩短，脊髓背角pERK、c－fos表达上调（ P＜0．05）。结论：右美托咪啶可减轻大鼠慢性神经病理性痛，抑制pERK、c－fos的表达可能是其作用机制之一。

ApoE4对大鼠在体海马L-LTP的影响及其分子机制的分析

探讨载脂蛋白E4(apolipoprotein E,apoE4)的神经毒性作用。将12只健康雄性SD大鼠随机分成对照组和实验组两组(n=6)。采用电生理手段,利用海马给药装置和刺激/记录绑定电极记录大鼠在体海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSP)和高频刺激(HFSs)诱导的晚期长时程增强(L-LTP),观察急性注射apoE4后对大鼠海马CA1区L-LTP的诱导及维持的影响。并且通过Western Blotting检测cAMP应答元件结合蛋白(CREB)的表达及其磷酸化水平,探讨apoE4影响L-LTP的分子机制。结果表明,HFSs前注射0.2μg apoE4并没有改变突触传递,对双脉冲易化(PPF)没有影响。但显著抑制L-LTP的诱导和维持,降低CREB的磷酸化水平。说明apoE4可以损伤海马L-LTP。这种神经毒性不是突触前神经递质释放所介导,而是通过降低突触后CREB活性实现的。

突触上与突触外的NMDA受体及其与阿尔茨海默病关系的研究进展

突触上的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体与学习记忆以及细胞的存活有着密切关系,而定位于突触外的NMDA受体则参与了细胞死亡通路的激活.本文主要从突触NMDA受体的结构和功能出发,阐述突触上与突触外NMDA受体分布的原因,阐明其介导不同信号通路的具体分子机制及其在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)中扮演的角色.最后,以突触外的NMDA受体为靶点,对AD疾病的治疗提出合理的展望,以期推动对该疾病的研究和治疗.

顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究

目的:探索顺铂诱导乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)再激活的机制。方法:将稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38分为2组,即磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)对照组及顺铂(Cisplatin)处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1(cAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、乙肝病毒蛋白表达(HBsAg、HBcAg)及病毒复制水平(HBV DNA、HBV mRNA);同样在成功构建稳定敲低CREB1(shCREB1)的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系HepAD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平(HBV DNA、HBV m RNA)及蛋白表达水平(HBsAg、HBcAg)。结果:稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049(P=0.010);HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060(P=0.003);HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047(P=0.005)。qRTPCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400(P=0.006);HBV m RNA相对表达量为3.084±0.256(P=0.000);以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的HepAD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平。qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125 (P=0.000);HBV m RNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056(P=0.000)。Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036(P=0.021)、1.681±0.015(P=0.000)。结论:顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调。

促育生精方治疗小鼠不育症的效果及其机制

目的研究促育生精方治疗小鼠不育症的效果及其机制。方法雄性清洁级昆明小鼠50只,随机分为空白对照组、模型组和促育生精方干预低剂量组、中剂量组、高剂量组,采用环磷酰胺(CP)造模方法建立小鼠少弱精症模型,促育生精方干预各剂量组在造模过程中给予促育生精方干预,共治疗35d。光学显微镜下观察各组精子密度与精子活力,采用RT-PCR法检测各组小鼠睾丸组织中cAMP反应元件调节因子(CREM)mRNA、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)mRNA、睾丸特异性CREM激活因子(ACT)mRNA的表达;用Western blotting方法检测各组ACT、CREM、CREB蛋白的表达。结果模型组精子密度与精子活力较空白对照组显著降低(F=2.83~121.16,P<0.05),小鼠少弱精症模型制备成功。促育生精方干预中剂量组、高剂量组精子密度显著高于模型组(F=121.16,P<0.05),低剂量组与模型组比较差异无显著性(P>0.05)。促育生精方干预低剂量组、中剂量组精子活力显著高于模型组(F=2.83、18.94,P<0.05),而高剂量组与模型组比较差异无显著性(P>0.05)。模型组ACT、CREM、CREB mRNA及蛋白表达量较空白对照组均显著降低(F=16.28~154.32,P<0.05)。与模型组比较,促育生精方干预中剂量组ACT mRNA和蛋白表达显著升高(F=29.04、64.28,P<0.05),而低剂量、高剂量组差异无显著性(P>0.05);低、中剂量组CREM mRNA和蛋白表达显著升高(F=17.77、41.83,P<0.05),高剂量组差异无显著意义(P>0.05);低剂量组CREB mRNA及蛋白表达显著升高(F=16.89、154.32,P<0.05),而中、高剂量组比较差异无显著意义(P>0.05)。结论促育生精方能有效提高少弱精症模型小鼠睾丸组织中ACT、CREM、CREB mRNA及蛋白的表达,改善小鼠精子质量。

细胞动粒蛋白Hec1启动子的结构及功能分析

细胞的分裂是一个严格调控,高度有序的过程.为了将复制后的染色体均匀、准确地传递给两个子细胞,细胞在分裂中后期受到纺锤体检验点的严格监控.Hec1定位于动粒,是纺锤体检验点调控的关键蛋白之一,它通过螺旋-螺旋结构域与其他动粒蛋白相互作用调节姐妹染色体的精确分离.为研究Hec1转录水平的调控机理,采用BLAST工具,从GenBank中搜索到了人Hec1基因上游的序列,并利用在线工具http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html提供的转录因子结合位点搜索引擎,对其5′启动子调节区段进行了分析.分析结果表明:在Hec1基因上游-200～-1序列内,存在E2F、ATF4和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)等转录因子调控元件.在结构分析的基础上,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR方法克隆了Hec1基因启动子,并构建了多个含启动子不同区段的pGL3荧光素酶报告基因表达质粒.瞬时转染HeLa细胞后的结果表明,-70～-63以及-155～-144之间的启动子区对维持荧光素酶活性最为关键.凝胶迁移实验证明,这两个区段分别能够和转录因子CREB以及ATF4结合.随后,采用野生型的以及含有133位磷酸化位点突变的CREB转染HeLa细胞,通过荧光定量PCR实验发现,Hec1的表达水平分别出现明显上升和下降.该结果表明,Hec1表达的调控是通过CREB的活化来完成的.