活化蛋白-1和cAMP反应元件结合蛋白在脂多糖注射大鼠肺组织中的变化及地塞米松的影响

目的探讨活化蛋白-1(AP-1)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)在急性肺损伤(ALI)发生发展中的可能作用,以及地塞米松的抗炎作用机制。方法采用脂多糖(LPS)5mg/kg颈静脉注射复制ALI大鼠模型,用凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)观察ALI大鼠肺组织AP-1和CREB的改变和地塞米松的影响。结果ALI大鼠肺组织AP-1的DNA结合活性在2h达到峰值,12h后接近正常水平。CREB的活性在1h即到达峰值,但直到12h并未完全达到正常水平。地塞米松对AP-1和CREB的DNA结合活性均有显著抑制作用。结论AP-1和CREB可能在大鼠的急性肺损伤的发生中发挥重要作用,在转录水平的调节可能是糖皮质激素发挥抗炎作用的重要机制之一。

细胞因子诱导的蛋白质巯基亚硝基化对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞中CREB蛋白的DNA结合活性的影响

目的:观察重组白细胞介素-1β(rIL-1β)和重组干扰素-γ(rIFN-γ)联合诱导的亚硝基化反应对cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的DNA结合活性的影响。方法:(1)分别用细胞因子(rIL-1β和rIFN-γ的混合物)、诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍(AG)及溶剂单独或联合孵育大鼠滑膜细胞12h,收集培养液上清进行一氧化氮(NO)含量测定;并提取各组总蛋白,其中细胞因子组的蛋白与巯基氧化修饰还原剂二硫苏糖醇(DTT)反应15min,采用生物素转化法与免疫印迹技术检测各组蛋白质的亚硝基化修饰水平。(2)分别用rIL-1β、rIL-1β和rIFN-γ的混合物、AG及溶剂单独或联合孵育滑膜细胞12h,提取各组核蛋白,其中rIL-1β+rIFN-γ组核蛋白与DTT反应15min,采用电泳迁移率改变分析技术观察各组CREB的DNA结合活性。结果:(1)细胞经rIL-1β和rIFN-γ孵育后,NO生成增多(P<0.01),蛋白质的亚硝基化修饰水平升高,而AG降低了NO的水平(P<0.01)并抑制了亚硝基化反应,DTT与总蛋白直接作用也可抑制亚硝基化反应。(2)rIL-1β和rIFN-γ共孵育明显抑制rIL-1β单独诱导的CREB的DNA结合活性(P<0.01),而AG抑制了rIL-1β和rIFN-γ的作用,DTT与核蛋白直接反应也可逆转细胞因子共孵育的作用,使CREB的DNA结合活性增高(P<0.01)。结论:IL-1β和IFN-γ共同孵育滑膜细胞可诱导细胞适度产生NO,使细胞内蛋白质的亚硝基化修饰水平升高,导致CREB发生可逆性巯基氧化修饰,抑制其DNA结合活性。

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-16-5p/CREB1轴减轻缺氧/复氧诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡的机制研究

目的:探究长链非编码RNA(LncRNA)FGD5反义RNA1(FGD5-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的影响以及对微小RNA-16-5p/cAMP响应元件结合蛋白1(miR-16-5p/CREB1)轴的调节机制。方法:将H9c2细胞分为对照组和H/R组(缺氧6 h,复氧6 h),然后将H/R组细胞分别进行转染,分为oe-NC组、oe-FGD5-AS1组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic-NC组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic组。实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法(RT-qPCR)检测细胞中FGD5-AS1、miR-16-5p、CREB1的mRNA水平;蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;CCK-8法测定细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶活性实验分别验证miR-16-5p和FGD5-AS1、CREB1的靶向关系。结果:与对照组比较,H/R组细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),miR-16-5p mRNA水平、细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与H/R组和oe-NC组比较,转染过表达FGD5-AS1基因的H9c2细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达增高,凋亡率及miR-16-5p、cleaved Caspase-3、Bax水平下降(P<0.05)。双荧光素酶活性实验验证了FGD5-AS1、CREB1均与miR-16-5p有结合位点。结论:过表达FGD5-AS1可能通过靶向下调miR-16-5p表达,上调CREB1表达,抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡。

盐诱导激酶抑制剂HG-9-91-01对小鼠脓毒症相关认知功能障碍的保护作用及其机制

目的:脓毒症相关认知功能障碍是脓毒症患者常见的并发症,目前病理机制不明,缺乏有效的防治手段。盐诱导激酶(salt-induced kinase,SIK)是调节代谢、免疫、炎症反应等的重要分子,与多种神经系统疾病的发生和发展相关。本研究旨在探讨SIK在脓毒症小鼠海马中的表达,以及SIK抑制剂HG-9-91-01在脓毒症相关认知功能障碍中的作用及其机制。方法:首先,将C57BL/6小鼠随机分为对照组(Con组)和脓毒症模型组[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组]。LPS组小鼠以8 mg/kg的剂量腹腔注射LPS,Con组小鼠予注射等体积生理盐水。在注射后1、3、6 d取小鼠海马组织,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和蛋白质印迹法检测SIK1、SIK2、SIK3的mRNA和蛋白质的表达水平。然后,将小鼠随机分为Con组、LPS组、SIK抑制剂组(HG组)。LPS组和HG组注射LPS构建脓毒症模型,HG组在注射LPS后的第3~6天以10 mg/kg的剂量腹腔注射HG-9-91-01,LPS组注射等体积溶媒。在注射LPS后的第7~11天进行Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)以评估3组小鼠的认知功能。行为学检测后取3组小鼠的海马组织,采用qPCR检测炎症因子和小胶质细胞标志分子的mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD68、离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba-1)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体(NMDA receptor,NR)亚型、cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponse element-binding protein,CREB)调控的转录共激活因子1(CREB-regulated transcription coactivator 1,CRTC1)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的蛋白质表达水平,免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测海马CA1区、CA3区、齿状回(dentate gyrus,DG)Iba-1阳性细胞的表达,并进行Sholl分析。结果:与Con组比较,LPS组小鼠海马组织SIK1、SIK2、SIK3的mRNA和蛋白质表达水平均上调(均P<0.05)。与Con组比较,LPS组小鼠的逃避潜伏期明显延长,目标象限停留时间百分比降低,运动速度下降(均P<0.05);与LPS组相比,HG组小鼠的逃避潜伏期明显缩短,目标象限停留时间百分比增加(均P<0.05)。与Con组比较,LPS组海马组织炎症因子[肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)]和I型小胶质细胞标志分子iNOS、CD68的mRNA表达均上调,而II型小胶质细胞标志分子CD206和精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的mRNA表达均下调;与LPS组比较,HG组TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表达均下调,而CD206和Arg-1的mRNA表达均上调(均P<0.05)。与Con组比较,LPS组海马组织iNOS、CD68、Iba-1的蛋白质表达均上调;与LPS组比较,HG组iNOS、CD68、Iba-1的蛋白质表达均下调(均P<0.05)。与Con组比较,LPS组海马组织CA1、CA3、DG区Iba-1阳性细胞数量均增加;与LPS组比较,HG组CA1、CA3、DG区Iba-1阳性细胞数量均减少(均P<0.05)。Sholl分析结果显示:距离小胶质细胞胞体8~38μm半径范围内,LPS组小胶质细胞突起与同心圆的交点较Con组明显减少(均P<0.05);在距离小胶质细胞胞体14~20μm半径范围内,HG组小胶质细胞突起与同心圆的交点较LPS组明显增多(均P<0.05)。与Con组比较,LPS组小鼠海马突触相关蛋白NR亚型NR1、NR2A、NR2B及IGF-1的蛋白质表达下调,磷酸化的CRTC1(phosphorylatedCRTC1,p-CRTC1)的蛋白质表达上调;与LPS组比较,HG组小鼠海马突触相关蛋白NR1、NR2A、NR2B及IGF-1的蛋白质表达上调,p-CRTC1的蛋白质表达下调(均P<0.05)。结论:脓毒症小鼠海马组织SIK表达上调,SIK抑制剂HG-9-91-01可改善小鼠脓毒症相关认知功能障碍,其机制可能与激活CRTC1/IGF-1通路,抑制神经炎症,增强突触可塑性有关。

心肺复苏大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B和磷酸化cAMP应答元件结合蛋白表达的变化及APP17肽的影响

目的探讨心肺复苏后大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，P13K）、蛋白激酶B（protein kirmse B，PKB）、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白（phosphorylation of cAMP response elementb inding protein，p-CREB）表达的变化，以及APP17肽对它们的影响。方法实验地点在宣武医院神经变性病学重点实验室。雄性Wistar大鼠21只，随机分3组，每组7只：假手术对照组（A组）、心肺复苏组（B组）、心肺复苏＋APP17肽组（C组）。自主呼吸循环恢复（return of spontaneous circulation，ROSC）标准为心电图出现正常的QRS波群，心室内压≥60mmHg，持续10min以上；夹闭气管制作大鼠心跳呼吸停止模型，行心肺复苏。当大鼠出现ROSC时，复苏组静脉注射生理盐水；APP17肽组静脉注射APP17肽10μg·（300g）^-1。对照组行假手术，静脉注射生理盐水。维持生命体征至2h，断头取脑，行冰冻切片。应用免疫组化法观察3组大鼠复苏2h后海马神经元P13K，PKB，p-CREB表达情况；三组中各取1只大鼠于ROSC后2h，分离海马；应用Westem-blot方法测定海马神经元PKB，p-CREB蛋白含量。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间数据用方差分析，以P〈0．05为差异具有统计学意义。结果免疫组化法显示：B组P13K阳性细胞表达为（2．75±1．80），略高于A组（2．53±1．53），差异没有统计学意义；而C组为（5．85±2．83），较B组增加，差异具有统计学意义（P〈0．01）。B组PKB和p-CREB阳性细胞分别较A组明显减少[（2．45±1．36）VS．（5．22±2．50），（P〈0．05）；（2．41±1．11）VS．（8．314±3．02），P〈0．01]；C组PKB和p-CREB阳性细胞分别较B组增高[（9．66±4．32）VS．（2．45±1．36），P〈0．01；（14．18±3．96）VS．（2．41±1．11），P〈0．01]。Western-blot法测定PKB，p-CREB蛋白含量B组较A组明显减少；C组较B组明显增加。结论心肺复苏大鼠ROSC2h海马神经元PKB，p-CREB表达降低，APP17肽能恢复神经元P13K，PKB，p-CREB的表达，对心肺复苏后海马神经元损伤有保护作用。

慢性丙型肝炎合并非酒精性脂肪性肝病患者血清RBP4和SREBP-1c水平变化分析

目的 探讨慢性丙型肝炎(CHC)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者血清视黄醇结合蛋白4(RBP4)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)水平变化及其临床意义。方法 2019年2月~2022年2月我院收治的CHC患者94例,接受肝穿刺活检和重组人干扰素-α2a联合利巴韦林治疗24周。使用全自动生化分析仪检测血生化指标,计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),采用ELISA法检测血清RBP4和SREBP-1c水平。结果 经组织病理学检查发现,在94例CHC患者中,合并NAFLD患者50例(53.2%),其中肝轻度脂肪变22例(44.0%)和中重度脂肪变28例(56.0%);CHC合并中重度脂肪变患者血清AST、ALT、ALP和GGT水平分别为(62.2±12.8)U/L、(87.2±11.5)U/L、(99.0±14.4)U/L和(69.4±10.3)U/L,显著高于CHC合并轻度脂肪变患者【分别为(53.6±10.1)U/L、(75.7±12.5)U/L、(83.8±12.7)U/L和(58.5±7.7)U/L,P<0.05】或CHC患者【分别为(51.7±8.5)U/L、(73.5±13.8)U/L、(81.6±10.9)U/L和(56.2±8.1)U/L,P<0.05】;CHC合并中重度脂肪变患者血清RBP4和SREBP-1c水平分别为(55.9±8.2)mg/L和(40.1±7.4)μg/L,显著高于合并轻度脂肪变患者【分别为(36.7±5.8)mg/L和(29.3±5.1)μg/L,P<0.05】或CHC患者【分别为(28.4±6.3)mg/L和(21.8±5.5)μg/L,P<0.05】;中重度脂肪变患者血清HbA1c和HOMA-IR水平分别为(5.7±0.5)%和(3.2±0.5),显著高于CHC合并轻度脂肪变患者【分别为(5.3±0.5)%和(2.5±0.4),P<0.05】或CHC患者【分别为(5.1±0.3)%和(1.9±0.3),P<0.05】;41例治疗应答组血清RBP4和SREBP-1c水平分别为(25.7±6.0)mg/L和(20.6±5.0)μg/L,显著低于53例治疗无应答组【分别为(48.5±7.4)mg/L和(35.5±6.3)μg/L,P<0.05】。结论 CHC合并NAFLD患者血清RBP4和SREBP-1c水平升高,可能影响对干扰素-α2a抗病毒治疗的应答,值得进一步研究。

miR-122-5p通过靶向CREB1抑制食管癌细胞及移植瘤的生长

背景与目的:miR-122在多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤细胞增殖、凋亡等,而cAMP反应元件结合蛋白1(cAMP response element-binding protein 1,CREB1)参与食管癌发展过程,研究miR-122-5p通过靶向CREB1对食管癌细胞及移植瘤生长的作用及机制。方法:选取2017年11月—2019年11月于福建医科大学附属泉州第一医院行肿瘤切除术后保存在液氮中的食管癌及相应癌旁正常组织(距癌边缘3~5 cm)标本43例。采用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测食管癌组织和细胞中miR-122-5p mRNA和CREB1 mRNA的表达。将细胞分为对照组、miR-NC组、pc-NC组、miR-122-5p mimic组、pc-CREB1组、miR-122-5p mimic+pc-CREB1组,根据LipofectamineTM2000说明书将miR-NC、pc-NC、miR-122-5p mimic、pc-CREB1质粒分别或联合转染进入EC109细胞中。采用双萤光素酶报告基因实验分析靶向关系,采用MTT法检测细胞增殖情况,采用克隆形成实验检测细胞生长能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测Ki-67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、活化胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2、CREB1蛋白的相对表达水平。所有裸鼠分为4组:control组、miR-122-5p mimic组、pc-CREB1组、miR-122-5p mimic+pc-CREB1组。在裸鼠左腋下皮下注射各转染过的EC109细胞。30 d后处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤,测定移植瘤体积和质量,采用免疫组织化学法检测Ki-67标记指数和胱天蛋白酶-3的表达水平。结果:miR-122-5p在食管癌组织和细胞中低表达,而CREB1在食管癌组织和细胞中高表达(P均<0.01)。miR-122-5p靶向下调CREB1表达。与对照组相比,miR-122-5p组食管癌细胞克隆数目减少,PCNA和Ki-67标记指数降低,细胞凋亡率增加,活化胱天蛋白酶-3和Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,食管癌EC109移植瘤体积和质量减小,Ki-67阳性细胞比率增加,活化胱天蛋白酶-3阳性细胞比率减少(P均<0.01)。过表达CREB1可逆转miR-122-5p对食管癌细胞和移植瘤增殖和凋亡的影响。结论:miR-122-5p通过靶向下调CREB1来抑制食管癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡,从而抑制食管癌细胞和移植瘤的生长。

原花青素对铁超载大鼠脑内二价矿物质元素、氧化应激及CREB、 GLUT-1基因表达的影响

目的探讨葡萄籽原花青素(GSPAs)对大鼠铁超载(IO)状态的改善作用。方法通过腹腔注射右旋糖酐铁的方法构建IO大鼠,并给予GSPAs,之后检测大鼠脑内二价矿物质元素含量、氧化应激状态及脑内环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)-1的表达。结果与NC组比较,IO组Fe、Ca含量明显升高(均P<0.05),Zn含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)活性、CREB与GLUT-1的表达量明显降低(均P<0.05);GSPAs组中Zn及Mg含量、GSH-Px活性、CREB与GLUT-1的表达量明显升高(P<0.05);与IO组比较,GSPAs组Fe、Ca显著降低,Zn、Mg显著升高,GSH-Px、CAT活性、CREB及GLUT-1表达量明显升高(P<0.05),Test组Fe含量明显降低,GSH-Px及CAT活性、CREB及GLUT-1表达量明显升高(P<0.05)。结论GSPAs可以在一定程度上对抗ID所引起的脑内二价矿物质元素紊乱、氧化应激及CREB、GLUT-1基因表达的下降。

转录因子CREB3L1在甲状腺癌组织中的表达及生物学意义

目的探讨转录因子环腺苷酸响应元件结合蛋白3-样1(CREB3L1)在甲状腺癌(THCA)组织中的表达及其临床意义。方法从GEO、ArrayExpress、SRA、TCGA等数据库检索下载CREB3L1 mRNA在THCA组织中的表达谱,应用Wilcoxon非参数检验检测CREB3L1 mRNA在THCA组织和正常甲状腺组织中表达水平的差异;计算CREB3L1表达值的标准化均数差(SMD)及汇总受试者工作特征(SROC)曲线下面积等指标,综合评估CREB3L1 mRNA在THCA组织中的表达水平及其对THCA的区分能力。用上述数据集批量获取CREB3L1在THCA组织中的相关过表达基因,应用CistromeDB预测CREB3L1转录靶基因,用clusterProfiler对CREB3L1在THCA组织中的相关过表达基因、CREB3L1转录靶标交集基因进行基因本体和京都基因与基因组百科全书功能注释。在THPA数据库中查看CREB3L1蛋白在THCA组织中的表达水平。结果与正常甲状腺组织比较,THCA组织中CREB3L1蛋白表达水平呈上调趋势。基于基因芯片、高通量测序数据集共纳入1175例THCA组织和791例正常甲状腺组织样本。CREB3L1 mRNA在THCA组织中呈高表达[SMD=0.11,95%可信区间(95%CI):0.01~0.20],集成SROC曲线下面积为0.62(95%CI:0.57~0.66)。CREB3L1蛋白在THCA组织中高表达患者5年生存率比低表达者低。交叉基因主要富集在细胞周期信号通路上,主要生物学功能为细胞器裂解。细胞分裂周期6蛋白(CDC6)与CREB3L1呈正相关。结论CREB3L1在THCA组织中高表达不利于患者的预后,有可能通过靶向基因CDC6参与了THCA的发生、发展。

顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究

目的:探索顺铂诱导乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)再激活的机制。方法:将稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38分为2组,即磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)对照组及顺铂(Cisplatin)处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1(cAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、乙肝病毒蛋白表达(HBsAg、HBcAg)及病毒复制水平(HBV DNA、HBV mRNA);同样在成功构建稳定敲低CREB1(shCREB1)的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系HepAD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平(HBV DNA、HBV m RNA)及蛋白表达水平(HBsAg、HBcAg)。结果:稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049(P=0.010);HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060(P=0.003);HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047(P=0.005)。qRTPCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400(P=0.006);HBV m RNA相对表达量为3.084±0.256(P=0.000);以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的HepAD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平。qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125 (P=0.000);HBV m RNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056(P=0.000)。Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036(P=0.021)、1.681±0.015(P=0.000)。结论:顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调。

微波辐射对大鼠睾丸组织pCREB、CREM及CBP蛋白表达的影响

目的探讨微波辐射对睾丸组织磷酸化环磷酸腺苷(cAMP)-反应元件结合蛋白(pCREB)、cAMP反应元件调节因子(CREM)及CREB结合蛋白(CBP)表达的影响及其意义。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(n=5)和辐射组(n=25)。辐射组接受30mW/cm2微波辐射5min,分别于辐射后6h,1、3、7、14d处死5只大鼠。对照组不接受辐射,于1d时活杀。采用免疫组织化学及Western blotting检测睾丸组织pCREB、CREM及CBP蛋白表达的变化。结果 pCREB、CREM和CBP均主要表达于睾丸生精小管精子细胞核。微波辐射后6h^14d(pCREB在1d时除外),pCREB和CBP蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),辐射后6h^7d CREM表达亦明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论 pCREB、CREM及CBP表达下调在微波辐射致生精细胞损伤中可能发挥重要作用。

Roux-en-Y胃旁路术对肥胖大鼠脂肪肝的影响及机制研究

目的探讨Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass surgery,RYGB)对肥胖大鼠脂肪肝的影响及可能的机制。方法将30只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为正常饮食组(ND组)、高脂饮食组(HFD组)及高脂饮食且接受RYGB组(HFD+RYGB组),每组10只,分别给予正常饮食、高脂饮食。饲养16周后,对HFD+RYGB组大鼠行RYGB,对ND组及HFD组行假手术。术后,ND组大鼠继续给予正常饮食,HFD组与HFD+RY G B组大鼠接受高脂饮食。术后第4周,处死大鼠,收集血样,采用EL IS A法测定大鼠血清TG、TC、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)浓度。观察大鼠肝脏外形,取肝脏组织,行H-E染色及油红O染色,显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。采用real-time PCR检测肝组织糖类应答元件结合蛋白(ChREBP)、固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达水平。结果HFD组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量高于N D组(P<0.05),HFD+RY G B组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量低于HFD组(P<0.05);HFD大鼠血清TG、TC、FFA水平高于ND组(P<0.05),HFD+RY G B组大鼠血清T G、T C、FFA水平低于HFD组(P<0.05);HFD组肝脏T G、T C含量高于N D组(P<0.05),HFD+RY G B组大鼠肝脏T G、T C低于HD F组(P<0.05);H-E及油红O染色结果显示,HFD+RY G B组干细胞脂质沉积、脂滴空泡减少;术后第4周,HFD+RY G B组大鼠肝脏中的C hREB P和S REB P-1 c的mRNA的表达量较HFD组均显著降低(P<0.05)。结论 RYGB能显著缓解肝脏脂肪沉积及血脂,其机制可能与抑制脂肪酸合成途径的关键分子ChREBP和SREBP-1c有关。

机械牵伸调节TGF-β3/CREB抗肌腱粘连的实验研究

目的观察机械牵伸促大鼠肌腱愈合、抗肌腱粘连的作用,并探讨其对转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)/环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)信号通路的影响。方法 SD大鼠18只,双侧后趾建立屈趾肌腱损伤修复模型,按随机数字表法分为3组,每组6只。牵伸组术后予以持续1周的被动机械牵伸,损伤组术后不予以牵引,假手术组仅在手术中暴露肌腱,不损伤肌腱即关闭伤口。术后第1、2、4、8周通过解剖学观察、组织学检查、实时荧光定量PCR反应和免疫组化观察肌腱愈合情况和目的基因的表达水平。结果各时间点牵伸组肌腱较损伤组瘢痕粘连程度减轻,肉芽组织生成减少,细胞排列更加有序(P<0.05)。愈合过程中牵伸组TGF-β3与CREB的mRNA水平在各时间点均显著高于损伤组,TGF-β1 mRNA的表达在术后早期(术后1周内)较损伤组明显降低(P<0.05),1周后2组差异无统计学意义。免疫组化染色结果提示牵伸组术后TGF-β3与CREB阳性表达强于损伤组,而TGF-β1阳性表达在术后1周时降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论机械牵伸可促进屈趾肌腱愈合并减少术后粘连,与TGF-β3和CREB表达的增加及TGF-β1表达的降低密切相关。

艾司氯胺酮对发育期大鼠慢性应激后学习记忆功能及海马NMDAR-CaMKⅡ-CREB信号通路的影响

目的评价艾司氯胺酮对发育期大鼠慢性应激后学习记忆功能及海马N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)-钙-钙调素依赖性蛋白激酶2型(CaMKⅡ)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响。方法清洁级健康SD大鼠60只,雌雄不拘,7日龄,体质量10~15 g,采用随机数字表法分为3组(n=20):对照+生理盐水组(CN组)、慢性应激+生理盐水组(NS组)和慢性应激+艾司氯胺酮组(ES组)。采用慢性不可预知性应激方法建立慢性应激模型。应激刺激结束后,ES组腹腔注射艾司氯胺酮10 mg/kg,NS组腹腔注射等容量生理盐水,连续7 d,1次/d。腹腔给药结束后,行Y迷宫实验和Morris水迷宫实验测定学习记忆功能;取静脉血样,采用ELISA法检测血清皮质醇和ROS浓度;随后麻醉断头取脑,分离海马组织,观察海马CA1区神经元病理学结果,采用Western blot法确定磷酸化NMDAR(p-NMDAR)/NMDAR、磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)/CaMKⅡ、磷酸化CREB(p-CREB)/CREB表达水平的比值。结果与CN组比较,NS组新臂停留时间缩短,进入新臂次数减少,逃避潜伏期延长,穿越原平台位置次数减少,血清皮质醇和ROS浓度升高,p-NMDAR/NMDAR比值、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值和p-CREB/CREB比值降低(P<0.05),神经元发生明显病理学损伤;与NS组比较,ES组新臂停留时间延长,进入新臂次数增多,逃避潜伏期缩短,穿越原平台位置次数增多,血清皮质醇和ROS浓度下降,p-NMDAR/NMDAR比值、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值和p-CREB/CREB比值升高(P<0.05),神经元病理学损伤减轻。结论艾司氯胺酮可改善发育期大鼠慢性应激后学习记忆功能,机制可能与降低氧化应激水平,增强海马NMDAR-CaMKⅡ-CREB信号通路活性有关。

益肾达络饮缓解EAE模型小鼠神经系统炎症的机制研究

目的研究益肾达络饮抑制β-制动蛋白1(β-arrestin1)表达对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠炎症因子、环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响,探讨益肾达络饮治疗EAE的机制。方法采用随机数字表法将60只小鼠分为正常组、模型组、中药组(益肾达络饮20 g/kg)、阳性对照组(醋酸泼尼松3.9 mg/kg)、β-arrestin1 siRNA腺相关病毒(AAV-β)组、AAV-β+中药组,每组10只。除正常组外,其余各组小鼠均制备EAE模型。AAV-β组、AAV-β+中药组小鼠通过尾静脉注射AAV-β干扰β-arrestin1蛋白的表达。造模第8天开始每天灌胃相应药液/生理盐水1次,连续14 d。检测小鼠神经功能评分,观察小鼠脑和脊髓组织的病理形态学变化,检测小鼠血清中炎症因子[白细胞介素2(IL-2)、IL-23、γ干扰素(IFN-γ)]水平,检测小鼠脑和脊髓组织中β-arrestin1、cAMP、PKA、CREB蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组小鼠神经功能评分、血清中炎症因子水平以及脑、脊髓组织中β-arrestin1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);脑和脊髓组织中PKA、CREB、cAMP蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);脑和脊髓组织中大部分神经元可见胞体皱缩深染及炎症细胞聚集现象,且存在不同程度的脱髓鞘改变。与模型组比较,各给药组小鼠神经功能评分、脑和脊髓组织的病理形态学变化及大部分指标(除AAV-β组脑组织中的CREB、cAMP蛋白外)均显著逆转(P<0.05或P<0.01)。与AAV-β组比较,AAV-β+中药组小鼠神经功能评分、血清中IFN-γ水平、脊髓中β-arrestin1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),脑与脊髓组织中PKA、cAMP蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论益肾达络饮可能是通过抑制中枢神经系统中β-arrestin1的表达,进而激活cAMP/PKA/CREB信号通路,减轻神经系统炎症,最终缓解EAE的症状。

p38 MAPK信号途径在高糖诱导的大鼠肾系膜细胞中激活的意义

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号途径与其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)、转化生长因子β1(TGF-β1)及细胞外基质表达的关系。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予低糖和/或甘露醇、高糖和/或SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂)干预。采用免疫细胞化学法观察p38 MAPK蛋白的表达情况;Western blotting检测p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白(p-p38 MAPK、p-CREB1)的表达;RT-PCR检测TGF-β1和FN mRNA的表达;放免法测定细胞上清液中层黏连接蛋白(LN)和Ⅳ型胶原的含量。结果与低糖组、低糖+甘露醇组相比,高糖刺激可使p38 MAPK蛋白发生核转移,p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,TGF-β1和FN mRNA的表达增强,LN和Ⅳ型胶原含量增加。SB203580能明显抑制p38 MAPK蛋白的核转移,降低p38 MAPK和CREB1的磷酸化,并抑制TGF-β1和FN mRNA表达,使LN和Ⅳ型胶原的分泌减少。结论高糖状态激活p38 MAPK信号途径参与了高糖诱导的肾小球系膜细胞TGF-β的表达和细胞外基质的分泌。

β-细辛醚对抑郁模型大鼠行为及海马MKP-1,MSK-1,CREB和Bcl-2的影响

目的:探讨β-细辛醚对抑郁模型大鼠行为学及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1),增强有丝分裂原和应激活化蛋白酶-1(MSK-1),cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和B细胞淋巴瘤/白血病因子-2(Bcl-2)表达的影响。方法:60只2～3月龄SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、氟西汀组和β-细辛醚组,每组15只。采用慢性轻度不可预见性应激加孤养复制抑郁模型,造模第2天开始,氟西汀组和β-细辛醚组灌胃给药,1次/d(氟西汀1.2 mg.kg-1.d-1,β-细辛醚25 mg.kg-1.d-1)。于实验第1,7,14,21天,分别进行体重、糖水消耗量检测和敞箱实验,对大鼠行为学改变进行评定。采用免疫组织化学染色检测MKP-1和Bcl-2蛋白表达,实时定量PCR对MKP-1,MSK-1,CREB和Bcl-2进行定量分析。结果:与模型组比较,氟西汀组和β-细辛醚组大鼠行为学指标显著改善,海马区MKP-1表达减弱、MSK-1,CREB和Bcl-2表达增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:β-细辛醚可有效改善抑郁模型大鼠的抑郁症状,其机制可能与减少海马区MKP-1,增强MSK-1,CREB和Bcl-2蛋白表达有关。

缺血性心肌病患者外周血MicroRNA-182、CITED2及HIF-1的表达及相关性研究

目的:探讨microRNA-182(miR-182)、cAMP应答元件结合蛋白反式作用因子(CITED2)及低氧诱导因子-1(HIF-1)在缺血性心肌病(ICM)患者外周血中的表达及相关性。方法:收集本院46例ICM患者设为ICM组,同期选择32例健康者为对照组。分析2组一般资料及心脏功能指标[氨基末端B型脑钠肽前体(NTproBNP)、左室射血分数(LVEF)、6min步行实验(6MWT)距离];用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测血浆miR-182的含量,采用ELISA法测定血清CITED2和HIF-1水平,并观察ICM组治疗前及治疗3个月后上述指标的变化;分析ICM患者血浆miR-182水平与有关因素的相关性。结果:ICM组治疗前CITED2、LVEF及6MWT距离明显低于对照组,NT-proBNP、HIF-1及miR-182表达明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。与ICM组治疗前比较,ICM组治疗后CITED2、LVEF及6MWT距离明显升高,NT-proBNP、HIF-1及miR-182显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。ICM组治疗前血浆miR-182的水平与CITED2、LVEF及6MWT距离成负相关(r=-0.427、-0.351、-0.298,P<0.05);ICM组治疗前血浆miR-182水平与HIF-1成正相关(r=0.337,P<0.05)。结论:外周血miR-182水平可作为ICM诊断及进行风险评估的生物标志物。miR-182可能通过其靶蛋白CITED2上调HIF-1,参与调控ICM的发生及发展。

异丙酚对内脏痛大鼠PSDC神经元NK-1受体内化和CREB磷酸化的影响

目的 评价异丙酚对内脏痛大鼠脊髓突触后背柱（PSDC）神经元神经激肽-1（NK-1）受体内化和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化的影响.方法 成年雄性SD大鼠,体重300～ 350 g,行鞘内置管和PSDC神经元逆行预标记术.取鞘内置管成功的大鼠30只,采用随机数字表法分为3组（n=10）：对照组（C组）、内脏痛组（VP组）和异丙酚组（P组）.VP组和P组直肠给予10％辣椒素溶液50 μl制备内脏痛模型,C组直肠给予生理盐水50μl;直肠给药前10 min时C组和VP组鞘内注射二甲基亚砜10μl,P组鞘内注射异丙酚20 μg（用二甲基亚砜稀释至10μl）.记录直肠给药后30 min内内脏疼痛评分,然后深麻醉状态下取腰骶段脊髓组织,采用免疫荧光组化检测脊髓PSDC神经元NK-1受体和磷酸化CREB（p-CREB）的表达水平.结果 与C组比较,VP组和P组内脏痛评分升高,脊髓PSDC神经元NK-1受体和p-CREB的表达上调（P＜0.05或0.01）;与VP组比较,P组内脏痛评分降低,脊髓PSDC神经元NK-1受体和p-CREB的表达下调（P＜0.01）.结论 异丙酚减轻大鼠内脏痛的机制可能与抑制PSDC神经元NK-1受体内化和CREB磷酸化有关.

右美托咪定对缺血性脑损伤大鼠神经功能及认知障碍恢复的影响研究

目的:探讨右美托咪定对缺血性脑损伤大鼠神经功能及认知障碍恢复的影响。方法:将缺血性脑损伤大鼠(n=45)随机平分为三组:模型组、地佐辛组与右美托咪定组。右美托咪定组在再灌注即刻腹腔注射右美托咪定40μg/kg,地佐辛组在再灌注即刻腹腔注射地佐辛40μg/kg,模型组在再灌注即刻腹腔注射相同容量0.9%氯化钠溶液,检测神经功能缺陷评分、血清白介素(IL)-1β、IL-6、micoRNA-329-3p表达水平及海马组织可调控cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)蛋白相对表达水平。结果:地佐辛组与右美托咪定组再灌注后第1、3、7天逃避潜伏期、神经功能缺陷评分低于模型组(均P<0.05),右美托咪定组低于地佐辛组(P<0.05);地佐辛组与右美托咪定组再灌注后第7天IL-1β、IL-6表达水平、micoRNA-329-3p相对表达水平低于模型组(均P<0.05),右美托咪定组低于地佐辛组(P<0.05);地佐辛组与右美托咪定组再灌注后第7天的大脑海马组织CREB、IL-1RA蛋白相对表达水平高于模型组(均P<0.05),右美托咪定组高于地佐辛组(P<0.05)。结论:右美托咪定可通过协调micoRNA-329-3p/CREB/IL-1RA轴的表达,促进缺血性脑损伤大鼠神经功能及认知障碍恢复正常,具有很好的脑保护效果。