马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R- PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。

应用Digoxigenin标记的cDNA探针检测香蕉束顶病毒

用非放射性的Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１１－ｄＵＴＰ取代３２Ｐ标记的ｄＡＴＰ或ｄＣＴＰ，标记克隆的ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂｃＤＮＡ，制备成探针．通过核酸斑点杂交对粗提取的ＢＢＴＶ，ＢＢＴＶ－ＤＮＡ，感染ＢＢＴＶ的香蕉植物的拟茎，球茎处的组织，新生叶片以及成熟后的叶片进行了检测．结果表明：ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１ｃＤＮＡ探针特异性强，不与ＣＭＶ—ＲＮＡ、无毒香蕉组培苗提取的核酸发生杂交反应；仅与粗提ＢＢＴＶ、ＢＢＴＶ－ＤＮＡ、ＢＢＴＶ侵染的香蕉组织的核酸提取物发生杂交反应．此探针灵敏度高，可检出含有ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂ的质粒ＤＮＡ的最小量为１０ｐｇ；测定感病香蕉植株的拟茎汁液的最高稀释度可达１∶１２８，相当于０．４ｍｇ病蕉组织中的病毒含量．测定同一病株不同部位的结果表明，ＢＢＴＶ在植物体内的分布不均匀，拟茎处组织中病毒含量最高，球茎处的组织以及新生叶片中的病毒含量次之。

用生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

用生物素-11-dUTP通过缺口平移将克隆于pST-B5和pST-B14质粒中的马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTV)cDNA进行标记,制备了生物素标记的PSTV-cDNA探针,在硝酸纤维素膜上进行核酸斑点杂交(Nucleic acid spot hybridization,NASH),检测了提纯的PSTV-RNA,带有PSTV全序列的质粒及感染PSTV的马铃薯植株提取液,前两者可检出的最低含量分别为8pg/斑点和0.35pg/斑点。以生物素标记的pST-B14和pST-B5为探针检测感染PSTV的马铃薯植株提取汁液。可测出的最高稀释倍数分别为126和162～243。

生物素标记GFV－cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用

以整合到质粒中的ＧＦＶ－ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ合成了生物素标记的ＧＦＶ单、双链探针。用合成的探针对提纯的ｃＦＶ－ＲＮＡ＿２、感染ＣＦＶ的昆诺藜叶及１８株而萄进行ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交检测表明：检测提纯病毒ＲＮＡ＿２的灵敏度为１．５ｐｇ／斑点，感染ＧＦＶ的昆诺藜提取液最高稀释度可达４０９６０倍；１１株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性，且汁液稀释４００～８００倍仍能测出，７株不显示典型扇叶症状的葡萄中３株受到ＧＦＶ的侵染。单、双链探针最适使用浓度分别为１／２００及１／１００。

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马铃薯中的PLRV

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３′端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测．结果表明，３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高．可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低量为２７．８ｐｇ／ｍｌ，未转ＣＰ基因接种ＰＬＲＶ的马铃薯叶片提取液的最高稀释度为１３７５．接种ＰＬＲＶ的转ＣＰ基因的抗性马铃薯块茎芽和叶片提取液的最高稀释度为０～１／１５．此探针和只转入病毒外壳蛋白基因，不接种ＰＬＲＶ的转基因马铃薯汁液不发生反应．表明，探针只与ＰＬＲＶ基因组ＲＮＡ特异反应，而不与外壳蛋白基因及其ｍＲＮＡ反应，从而为表达ＣＰ基因的转基因马铃薯中ＰＬＲＶ的检测和抗病性鉴定建立了一种可靠的灵敏的分子生物学技术．此项技术已用于转ＣＰ基因马铃薯Ｄｅｓｉｒｅ，Ｆａｖｏｒｉｔａ。

三种PCR引物法制备生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因cDNA探针检测效果的比较

采用正义、反义引物及正义和反义引物双链PCR法制备了生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因的cDNA探针。检测结果表明,三种PCR引物法标记的cDNA探针显色灵敏度均可达到10pg/μL,对目标基因DNA的检测灵敏度可达90pg/μL,但反义引物PCR法标记探针的检测效果要好于正义和反义引物双链PCR法制备的探针;在目标基因DNA浓度一定的情况下,探针的浓度对检测效果的影响并不大;正义、反义引物PCR法制备的探针可不经煮沸变性处理直接使用;用50ng/mL浓度的反义引物PCR法制备的生物素标记cDNA探针可检测到带毒啤酒花叶片和花瓣中的啤酒花潜隐病毒RNA。

光敏生物素标记cDNA探针在肾综合征出血热实验诊断中的初步应用

本文用光敏生物素标记的R3 cDNA探针杂交检测了HFRS患者外周血淋巴细胞、血清和尿沉淀细胞中HFRS病毒核酸。结果42份淋巴细胞标本中30份为阳性,48份血清标本中有24份出现阳性杂交信号,81份尿沉淀细胞标本中53份为阳性,表明将此光敏生物素标记的cDNA探针用于HFRS实验诊断和致病机理的研究是可行的。

猴D型逆转病毒Ⅰ型cDNA合成及其分子克隆的建立

利用随机引物法反转录合成SRV-1 ss-cDNA和ds—cDNA.将ds—cDNA平端连接到质粒pUC19中,转化E.Coli.DH5α菌.氨苄青霉素、X-gal培基和菌落杂交筛选,克隆阳性重组率为20.7%.EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切分析,12.7％的插入片段大于500bp。Southern杂交进一步确证,所选三株重组质粒(pSRV-127、pSRV-156和pSRV-169)的探针用插入片段(0.9kb、1.0kb和1.4kb),是SRV-1 cDNA片段.光敏生物素标记纯化pSRV-169DNA和pSRV-156cDNA片段制备探针,前者用于检测SRV-1病毒RNA,后者用于检测纯化病毒颗粒。碱性磷酸酶系统染色。

应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。

水稻普矮病毒基因组第十片段cDNA的克隆及其体外转录

由提纯的水稻普矮病毒(Rice Dwarf Virus,简称 RDV)中分离出其基因组 dsRNA,以人工合成的分别与 RDV 第十片段(RDV-S_(10))3′末端互补的两段核苷酸作为引物,合成并克隆 S_(10)全长 cDNA,体外转录成 RNA。用同位素标记的其 cDNA 作为探针,打点杂交,能检测出浓度为2×10^(-12)g 的病毒核酸和直接测出1.25×10^(-4)g 染病水稻中的病毒核酸。

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计引物,利用PCR扩增得到PCV2 BF株341 bp的核酸片段,用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应,可检测的最低PCV2 DNA含量为1.78 pg。对30份临床组织样本进行了检测,并与PCR比较,结果表明,阴性符合率为100%,阳性符合率为88.9%。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布,结果表明,感染后3 d,从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号,感染后21 d,肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号,至感染后42 d,可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明,建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性,可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。

探针浓度值对LSAW-bisPNA传感器检测系统的影响

目的探讨双体肽核酸(bisPNA)探针浓度值对漏声表面波(LSAW)-bisPNA基因传感器检测系统的影响。方法LSAW基因传感器表面分别固定终浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0μmol/L的bisPNA探针后,分别观察其与相应的HPV靶序列杂交时相位变化及反应所需时间。结果与HPV靶序列杂交所引起的相位变化值是先升后降,以1.0μmol/L探针浓度为分界线;杂交平衡时间上各组间未见明显的变化趋势。结论1.0μmol/L bisPNA探针固定浓度最为适宜。

利用原位杂交技术检测新疆牛结核病标本中结核菌的研究

采用原位杂交技术将地高辛标记的牛结核杆菌特异性探针即２４８ｂｐ基因片段用于检测１０份患病牛肺病变组织福尔马林固定切片标本。结果表明：基因探针原位杂交技术对切片标本的检出率较常规涂片染色高，分别为８０％和５０％，其定位观察到组织切片中的结核杆菌，又能获得有关细菌及其周围组织的原有位置关系，是一种敏感、特异的诊断方法，适应于固定标本、涂片标本的结核菌检测。

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。

用光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒

用光生物素标记牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitisvirus,IBRV)9.6kb DNA片段做探针,可检测出10pg的IBRV DNA、1个TCID50的病毒和1～10个TCID50的实验感染牛精液。用核酸探针检测IBRV与分离病毒的符合率为84.4％。若将采集的样品在牛肾细胞上增毒一次,再抽提培养物的核酸,用核酸探针检测,则敏感性和符合率大为提高。

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针，建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法，同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较，发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ，但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断，可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性，以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制，打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化，对治疗的评价，以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。

应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株。结果分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交。应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符。结论应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值。

松材线虫杂交探针制备与检测技术

选用松材线虫特异引物对M05F2/R1(F1:5-′CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3,′R1:5′-TG-GCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3′),以D ig-11-dUTP代替部分dTTP,采用PCR技术,直接扩增松材线虫特异片段作为松材线虫地高辛探针。结果表明,地高辛探针长度一致,为600 bp。产量较高,探针质量浓度达280mg/L。采用探针D IG-F2/R1对线虫基因组DNA进行点杂交,19个松材线虫株系均表现有较强的杂交信号,而8个拟松材线虫、1个霍夫曼尼伞滑刃线虫、1个大核滑刃线虫、1个长尾属线虫均无杂交信号。且用该探针可以稳定地检测出单条松材线虫。因此,该探针特异性强,灵敏度高。该探针及其配套的杂交检测技术可以用于检测线虫样本中是否含有松材线虫。

鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制

用特定引物通过PCR合成了经地高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针,通过交叉斑点分子杂交,这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用此试剂盒,对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交,可在24～36 h内完成检测并报告结果。