光质对离体诱导棕色棉纤维基因表达影响的cDNA-SRAP分析

以离体培养棕色棉纤维(暗培养10 d)为材料,分别用红、黄、蓝、白光进行处理,在24 h光照条件下培养10d后,利用cDNA-SRAP技术对其基因表达进行分析。对其中16个差异片段测序后进行同源性比对和功能分析表明:2个序列功能与植物抗逆性有关(CNGC5类似蛋白基因、(+)-δ-杜松烯合成酶);3个序列与生物代谢相关(β-1,3-葡聚糖酶13基因、质膜胆碱转运蛋白基因、tau类谷胱甘肽转移酶基因)。其中,谷胱甘肽转移酶基因与原花青素合成前体物质的转运有关,光质可能通过影响谷胱甘肽转移酶基因进而对原花青素的合成产生影响。

cDNA-SRAP标记在玉米氮素营养诊断上的应用初探

为探讨对玉米氮素营养状况进行分子诊断的可行性,以大面积推广的玉米(Zea mays)杂交种郑单958为材料,用cDNA-SRAP标记的方法研究了玉米幼苗在不同氮素水平下基因表达的差异,对其中的一些差异表达片段进行了克隆和测序,并通过Real-time PCR鉴定了克隆的差异表达片段的真实性。结果表明:不同的SRAP标记引物对扩增效率不同,玉米基因表达受到氮素水平的严格调控,cDNA-SRAP标记的方法与Real-time PCR检测到的基因表达情况基本一致,基因差异表达片段N1、N9、N20、N30可作为玉米缺氮的分子诊断的候选靶标。因此cDNA-SRAP标记可以用来研究植物营养状况的分子诊断。

甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的cDNA-SRAP差异显示

为探寻甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽表达差异的分子基础,探索cDNA-SRAP差异显示的可行性,选用培育7年的重组自交系群体(RILs),根据群体分离分析法(bulkedsegregantanalysis,BSA)构建了种子的RNA混合池,利用cDNA-SRAP法进行了差异显示研究。996对SRAP引物组合扩增出2100条带,2次扩增重复率为65.2%,其中在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有12条,长度在100～300bp之间。选择其中7条差异片段,进行回收、克隆和测序,发现2个片段分别与拟南芥的NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白3具有很高的同源性。结果表明,利用SRAP方法可以对甘蓝型油菜cDNA混合池进行差异显示研究,2条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因表达相关。

利用cDNA-SRAP分析赤霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达

【目的】探寻赤霉素诱导甘蔗节间伸长基因表达差异的分子基础,为分离节间伸长相关基因奠定基础。【方法】以新台糖22号为材料,在伸长初期以浓度为200mg·L-1的赤霉素进行叶面喷施,以喷施清水为对照,分别提取总RNA进行等量混合,获得2种不同处理的样品池,采用cDNA-SRAP技术进行基因差异表达分析。【结果】700对引物组合共扩增到约15000条、大小在50—750bp的cDNA片段。在GA3处理组和对照组中,甘蔗幼茎中的转录水平具有很大的差异,获得134条差异条带。从反向Northern杂交结果阳性的S-TDFs中选取24个片段进行克隆和序列分析,按照功能可以将24个差异表达基因片段S-TDFs(cDNA-SRAP transcriptderive dfragments)分为6类,分别为能量与代谢相关基因(4条,占总数的16.67%)、未知功能蛋白基因(6条,占总数的25%)、未知基因(10条,占总数的41.66%)、细胞壁生物合成与修饰相关基因(1条,占总数的4.17%)、信号传导相关基因(2条,占总数的8.33%)和转录因子相关基因(1条,占总数的4.17%)。【结论】cDNA-SRAP完全适用于差异表达分析,从中获得一些与甘蔗节间伸长相关的差异基因片段,这些基因可用于甘蔗节间伸长的分子机理研究。

cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术在植物基因差异表达上的应用及其分析比较

对cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术在植物上的应用研究进行了介绍,指出cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术已逐渐成为基因表达研究的重要工具,是构建转录图谱、定位目标性状位点、研究差异基因表达等研究的主要手段,具有广泛广阔的应用前景。但是cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术均具有一定的缺限,主要表现在获得的差异片段还不够全面丰富。cD-NA-AFLP可以扩增到扩增较多的带,但试验程序比较繁琐、昂贵而且耗时较长、操作较困难;而cDNA-SRAP相对比较简便、便宜而耗时较短,较易操作。因而将cDNA-AFLP与cDNA-SRAP技术结合起来,可望得到更全面丰富的差异片段,从而在植物基因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机理研究等方面发挥更大的作用。

利用cDNA-SRAP分离结球甘蓝抗黑腐病相关基因的研究

为了挖掘抗病基因,探寻甘蓝抗黑腐病机制,选取抗性材料C7,在幼苗4-5片真叶期,喷施菌液浓度为1.0×108cfu/mL的细菌悬浮液,喷施蒸馏水作对照,提取接种后1,3,5 d的总RNA进行等量混合,获得2种不同处理的样品池。采用SRAP分子标记技术进行基因差异表达分析,结果显示：60对SRAP引物组合共扩增出大小在100-750 bp的685条带,平均每对引物扩增11条带,共检测到24个多克隆位点。回收测序后,将得到的9条差异表达片段TDFs（Transcript derived fragments）进行克隆和序列分析,其中3条差异基因片段未搜索到任何同源蛋白,其余6个基因均按功能分类,可分为涉及能量代谢、植物细胞壁蛋白相关基因、液泡加工酶基因和未知功能基因。表明cDNASRAP方法简单、重复性好、试验成本低,完全适用于差异表达分析,从中获得一些与甘蓝抗黑腐病相关的差异基因片段,可用于甘蓝抗黑腐病的分子机理研究。

山楂果实不同组织RNA提取方法比较及cDNA-SRAP分析体系的建立

以软籽山楂为材料,采用改良Trizol法和改良热硼酸法提取果肉、种核和种子部位的总RNA。经核酸蛋白测定仪测定和凝胶电泳显示:改良Trizol法可以从山楂果肉、种核部位提取到高质量的RNA,所得RNA的A260/A230均大于2.0,A260/A230分别为1.92和1.84,但其产量较低,分别为60.3μg·g-1和46.2μg·g-1。改良Trizol法不能从种子中提取得到完整的RNA。改良热硼酸法可以从山楂果肉、种核和种子部位提取到高质量的RNA,所得RNA的A260/A230均大于2.0,A260/A230分别为1.88、1.93和1.93,其RNA产量也较改良Trizol法高,分别为600.2、507.4和490.8μg·g-1。将改良热硼酸法分离的RNA用于cDNA-SRAP分析,获得的条带清晰,表明其质量完全可以满足进一步分子生物学研究的要求。

用cDNA-SRAP技术分离蜡梅花发育不同时期差异表达基因片段

应用cDNA-SRAP标记方法,筛选出19对引物,对8-12月所采集的24个蜡梅花芽(花朵)样品所制备的cDNA模板进行扩增,研究蜡梅花发育各时期的基因表达情况,并对部分差异片段进行了表达分析和功能预测。结果表明,cDNA-SRAP分子标记技术操作简便,能产生较丰富的条带,是进行差异显示分析研究的有效途径;与玉米淀粉去分支酶基因、欧洲山杨纤维素合成酶基因、玉米抗锈病基因和小麦多酚氧化酶基因相似性高的差异表达片段,可能对蜡梅花发育和抗性表现起着重要的作用。

SRAP-cDNA方法在植物基因差异表达分析中的应用

对SRAP技术的原理方法、优点进行了介绍,并阐述了SRAP-cDNA方法的实验条件优化、应用现状及前景,表明SRAP-cDNA方法具有简便、重复性好、实验成本低等优点,可以在研究植物基因差异表达领域广泛应用,并成为作物育种、杂种优势分析等工作的重要工具。

玉米cDNA-SRAP反应体系的优化

利用cDNA-SRAP技术对玉米耐低磷相关基因进行mRNA水平的基因差异表达分析,并对cD-NA-SRAP扩增条件进行了优化,获得了最佳的cDNA-SRAP反应体系：总体积20μL,cDNA模板140 ng,dNTP 0.25 mmol/L,Mg^2＋浓度为1.8 mmol/L,正、反向引物浓度分别为0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。

黄鳝粘液雌雄差异的cDNA-SRAP分析

采用cDNA-SRAP技术对黄鳝雌雄粘液进行基因差异表达分析,筛选黄鳝体表粘液中与性别相关的分子标记。从64对引物组合中筛选出12对引物组合,共获得123个稳定清晰的扩增位点,并筛选出4条雌雄有差异的条带。这4条特异性条带经过回收、克隆、测序后,将测序结果进行Blast分析,结果发现在GenBank中只有片段1与白鳍豚硫酸盐/硫代硫酸盐CYSA样进口ATP结合盒蛋白有较高的同源性。根据片段1的序列设计1对引物进行半定量RT-PCR反应,结果发现,片段1在雌雄黄鳝体表粘液均可获得扩增条带,但其在雄性粘液中的表达量显著高于雌性。这可能是由于雌雄黄鳝粘液中所存在的表皮细胞和粘液腺细胞有差异所致。

不同壳色三角帆蚌外套膜基因的SRAP-cDNA差异分析

三角帆蚌幼蚌壳表面颜色和放射条纹表型遗传分离均符合孟德尔单基因位点的一对等位基因调控规律。研究为进一步阐释其壳色遗传分子调控机制,应用群体分离分析法(BAS)和SRAP-cDNA比较了两种典型外壳色表型三角帆蚌外套膜组织的基因表达差异。采用30个引物组合获得5个差异片段,回收克隆测序获得14条差异序列,大小在195—339 bp之间,通过序列比对,获得与2个相似蛋白序列,包括类二氢嘧啶脱氢酶和类锌指MYM-1型蛋白,而未发现与色素合成相关基因和蛋白,但三角帆蚌外壳色表型差异是否与嘧啶代谢和类锌指蛋白参与的基因表达调控有关还有待进一步研究。

茶树cDNA-SRAP体系正交优化研究

采用正交设计L9(34)对茶树良种湘妃翠cDNA-SRAP体系中的四因素在三个水平上进行优化试验,在25μL反应体系中,最优组合为Mg2+浓度3.0mmol/L、Taq DNA聚合酶0.1U/μL、引物浓度0.8umol/L、dNTPs浓度0.2mmol/L。以筛选出的引物组合Me6/Em6、Me7/Em6和Me7/Em7在湘妃翠、安吉白茶、龙井长叶、安茗早和湘波绿五个茶树品种材料上进行验证,表明该组合具有较好的稳定性。

白花泡桐茎和叶差异表达的cDNA-SRAP分析

以白花泡桐茎和叶为材料,利用cDNA-SRAP分子标记技术,对其进行基因表达的差异分析。从64对引物中筛选出25对扩增效果较好的引物对进行扩增,检测得到36个差异片段,2次PCR扩增重复率为66.8%。经挑选回收、克隆和测序,最终测得23条差异片段序列,长度主要在400~1 700bp之间。经BLASTX进行比对和功能分析,16条与已知功能基因有较高同源性,包含能量与代谢(34.78%)、蛋白质合成(8.70%)、细胞壁相关(4.35%)、信号传导与胁迫响应(8.70%)及复合影响(13.04%)等多个方面;7条与未知功能基因序列有较高同源性。

利用cDNA-SRAP技术分析天麻与蜜环菌共生时差异表达基因片段

目的:探索天麻与蜜环菌共生时的分子调控机制。方法:以红天麻与蜜环菌共培养时不同形态的白麻作为研究材料,利用cDNA-SRAP技术分析红天麻在与蜜环菌共生前后的差异表达基因。结果:被侵染的白麻在转录水平获得53条特异的差异条带,未被侵染白麻为64条。从被侵染白麻的差异表达基因片段S-TDFs中选取稳定的31个片段进行TA克隆和序列比对分析,按照功能预测可分为7类,即能量与代谢、转录调控、细胞膜通透性、自交不亲和性、染色质重塑、抗性相关及未知功能基因。部分S-TDFs荧光定量(qPCR)结果也与cDNA-SRAP表达谱结果一致。结论:cDNA-SRAP技术适宜分析天麻与蜜环菌共培养时差异表达基因,可作为研究二者共生分子调控机制的前期有效手段;能量和代谢方面的S-TDFs在分子水平上验证了天麻的生活史离不开蜜环菌。

应用cDNA-SRAP标记比较苹果梨与延光梨果皮性状的表达差异

以苹果梨和延光梨果皮为试材,对盛花后7周的苹果梨和延光梨果皮cDNA进行SRAP-PCR检测,找出2个梨品种(系)在转录水平的差异,共扩增出444条可被应用的条带。2个品种间的相似性极高,仅检测到2个差异片段,多态性为0.45%。其中,ME7-EM5引物组合扩增出的差异条带是因为核苷酸序列包含内含子序列,为模板中存在的少量DNA扩增;ME4-EM3引物组合扩增出的差异条带经回收测序,于Blast上比对得知其为植物凝集素基因,经半定量RT-PCR验证多态性消失,判断差异条带可能是由于苹果梨与延光梨引物结合位点存在差异而致。

应用cDNA-SRAP研究大黄不同功效组分型特异表达基因

目的:探讨生态环境和遗传背景相同条件下3种不同化学变异类型大黄在基因表达水平上的差异,揭示大黄种内变异的分子机制。方法:采用cDNA-SRAP生物信息学方法,对不同化学变异类型大黄地下组织特异表达的基因进行分析和功能预测。结果:共获得5条差异表达基因片段和4条表达量有明显差异的公共条带,其中4条功能已知,分别与植物生长发育及光信号转导、植物抗病性及水分运输相关,5条功能未知。结论:克隆了不同化学变异类型大黄特异表达的基因,为筛选优良变异类型、品种选育、功能基因组的研究提供参考。

梨果实愈伤组织褐腐病菌侵染过程cDNA-SRAP差异分析

梨果实褐腐病危害果实,可造成果实运输和储藏过程中严重的经济损失。本研究构建了褐腐病菌侵染梨果实愈伤组织离体系统,对梨褐腐病菌侵染其果实愈伤组织不同时期进行细胞学观察分析,基于cDNA-SRAP技术,分析该过程中差异基因表达,以期分离克隆与梨果实抗病反应过程相关的防卫基因。结果表明:与未侵染的梨果实愈伤组织相比,侵染12～60h过程中梨果实褐腐病菌从表面逐渐深入到内部细胞;30个SRAP引物组合共扩增出457条带,其中差异回收条带数为16条,差异比率为3.5%。最终获得5条差异基因表达条带。核酸序列同源性分析表明,其中1条差异基因片段未搜索到任何同源蛋白,2条差异基因片段经序列比对,序列相似度一致,与苹果属的肉桂醇乙酰脱氢酶(CAD)同源性为96%;其他2条差异基因片段分别与DNA结合蛋白(DBP)和寡肽转运蛋白(OPT)基因序列同源,其同源性为85%和78%,因此暂将这3个基因命名为PbCAD、PbDBP和PbOPT。荧光定量PCR结果表明,PbCAD基因在褐腐病菌侵染梨果实愈伤组织12和24h时相对表达量最高,为对照的2.94和2.66倍;PbOPT基因在褐腐病菌侵染梨果实愈伤组织12～36h时相对表达量明显升高,为对照的2.17～2.46倍,而其他时期表达量均与对照接近;PbDBP基因表达量在整个侵染时期均与对照接近。因此我们推测PbCAD和PbOPT基因可能为梨褐腐病菌侵染梨果实愈伤组织响应的相关防卫基因。

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因(JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2)有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因(UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶)同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。

不同钾水平下花魔芋差异表达基因分析

为了探索魔芋对不同水平钾素营养的反应机制,提取施用低、中、高水平硫酸钾5d后的富源花魔芋叶片总RNA,合成了c DNA,采用优化的c DNA-SRAP技术体系分析了在低钾、中钾、高钾水平下富源花魔芋叶片的差异表达基因,并对其进行了生物信息学分析。结果显示:29对引物组合共扩增出507条基因片段,其中差异片段126条。相对于中钾处理,低钾、高钾处理的差异片段包括抑制型表达片段19条,诱导型表达片段14条,上调表达型片段29条,下调表达型片段64条。选取表达量高的13条差异片段进行回收测序,并在NCBI上进行BLAST比对,共比对出9条差异片段的同源序列,其中4条与已知功能基因(谷氨酰胺酰-t RNA合成酶、β-ATP合成酶、GTP结合蛋白、核苷酸还原酶)有较高同源性,5条与假定基因或预测基因同源性较高,剩余序列未找到同源序列,可能是一些新的魔芋与钾营养吸收利用相关的基因,具体功能还有待于进一步研究。