西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究

采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长1322bp,其包括的137bp的5′端非翻译区,57bp的3′端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128bp开放阅读框。与其他物种比对,该基因具极高的保守性。同时也利用同源克隆技术获得了西伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上。以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利亚鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达。其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍。同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点。本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据。

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用 RT- PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物 ( CMV- PE)全长 RNA3.经核苷酸序列测定 ,明确 PE分离物 RNA3全长 2 2 16nt,含有 2个开放阅读框 ( ORF) ,其中 5'端的 ORF( 12 1- 963nt)编码2 79aa的 3a蛋白 ,3'端 ORF( 12 60 - 1916nt)编码 2 18aa的 CP蛋白 .5'端非编码区 ( NR)长 12 0 nt,基因间隔区 ( IR)长 2 96nt,3'端 NR区含 30 1个碱基 .PE分离物编码的 3a蛋白中最明显的特征是在 136- 141位有一个独特的 VWCL SS区域 .将 CMV- PE的 RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属 CMV亚组 I的其它分离物进行比较 ,发现症状相似的 CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性 。

狂犬病病毒口服疫苗株SRV_9基因组全长cDNA的克隆及特性分析

为了解狂犬病病毒口服疫苗株SRV9的基因序列与生物学特性的关系,明确其作为疫苗株的分子基础,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),获得了贯穿全基因组的3个重叠的cDNA片段。将获得的cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体上并进行序列测定,对测序结果进行拼接得到全长cDNA序列(GenBank登录号:AF499686)。SRV9株与亲本株SADB19全序列比较分析显示,二者同源性为99.8%,SRV9的变异主要发生在糖蛋白的编码区域,共有5个碱基发生改变,在转录酶蛋白编码区出现2个碱基的改变,其他蛋白编码基因均未出现突变;氨基酸比较分析显示,在转录酶蛋白氨基酸序列发生2个改变;糖蛋白成熟肽的第34位、292位、333位和338位氨基酸分别发生了Gly→Glu,Ala→Thr,Arg→Ser,Ile→Val的改变,其中第34位氨基酸位于第抗原区,第333位和338位氨基酸位于第抗原区。这些抗原位点的突变可能是引起病毒蚀斑特性改变、毒力降低和免疫原性及安全性提高的重要原因。

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因(TS)的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1 503 bp,开放阅读框(ORF)为1 071 bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39 250.3 Da,理论等电点(PI)为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)嗜好在PAM和其他单核细胞上生长 ,如果把PRRSV作为一种病毒活载体 ,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的免疫系统 ,更好地刺激机体产生免疫应答。本实验根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点 ,将PRRSV基因组设计为 8段进行了反转录和扩增 (RT_PCR) ,将得到的片段克隆到质粒pBluescriptIISK(_)或pMD 18T_vetcor中。在扩增 5’端时 ,运用 5’RACE获得了基因组 5’最末端序列 ,在亚克隆入pOK12前在 5’端上游引入了T7启动子序列。选取一个克隆在 3’端紧挨ORF7下游引入了PacⅠ位点 ,以期作为感染性分子克隆的分子标志。将扩增片段在pBuescriptIISK(_)中进行了部分连接后 ,亚克隆于低拷贝质粒pOK12中 ,在pOK12中进行了长片段的连接 ,并获得了基因组全长cDNA克隆。进行全基因测序后 ,在 3处发现有 6个核苷酸的缺失 ,运用插入突变修补丢失的碱基 ,最终获得了含有PRRSVCH_la株基因组全长cDNA的重组质粒pOKCH_laF和含有分子标志PcaⅠ的基因组全长cDNA克隆pOKCH_laPacIF。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

泌盐植物长叶红砂质膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因(RtSOS1)全长cDNA的克隆及序列分析

长叶红砂为内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有珍稀泌盐,强旱生小灌木,对盐渍荒漠环境具有极强适应性。利用RT-PCR和RACE技术从该植物中分离出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(RtSOS1),该cDNA全长为3 829bp,开放阅读框为3 438 bp,编码一个含1 145个氨基酸的蛋白质,推测分子量为126.76 kDa。氨基酸序列的生物信息学分析推测,该蛋白N端含有11个跨膜结构域,C端为一个长约700个氨基酸的亲水性尾,具有磷酸化和自我抑制结构域。同源性比对和系统发育分析证实,RtSOS1与其他植物的质膜Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较近。

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03全长cDNA克隆的构建

为构建猪捷申病毒(Porcine testhovirus,PTV)感染性克隆,进行病毒基因组结构、功能及新型疫苗研究,根据NCBI发表的PTV Swine/CH/IMH/03株及Talfan株核苷酸序列,设计并合成了4对特异性引物,PCR扩增并克隆覆盖PTV Swine/CH/IMH/03全长基因组的4个片段。经过反复拼接和测序,最终将PTV全长cDNA定向克隆到pBluescript SK(+)中。PCR、双酶切及测序鉴定证明PTV全长cDNA克隆构建成功。与Swine/CH/IMH/03亲本株及NCBI登录的其他PTV毒株序列比对发现,该克隆只有3个位点存在核苷酸及氨基酸突变,分别位于2A、2C及3D中。

Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建与分析

【目的】建立Ⅰ型鸭病毒性肝炎(Duck hepatitis virus,DHV)的反向遗传系统。【方法】根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)ZJ-V/2006株全基因组序列设计并合成5对特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重叠片段A、B、C和DE片段分别克隆到载体pBluescriptⅡKS(+)中,获得了DHV-ⅠZJ-V/2006株全长基因组cDNA克隆pBLDHV。在扩增5′末端时,引入ApaⅠ酶切位点和SP6启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入NruⅠ酶切位点,以供cDNA模板的线性化之用。【结果】核酸序列分析表明,DHV-ⅠZJ-V/2006株基因组全长为7 711个核苷酸,与DHV-ⅠZJ-V BHK-21细胞分离株的同源性为99.9%;全长基因组中有6个核苷酸发生突变,均未导致对应的氨基酸发生改变,为沉默突变。【结论】成功构建了DHV-ⅠZJ-V/2006株基因组全长cDNA。

剑尾鱼P-糖蛋白基因全长cDNA克隆、分析及组织分布

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)为ABC转运体超家族的主要成员,分布于细胞膜,依赖ATP供能,可将细胞内的亲脂性毒物或药物逆浓度泵出胞外,在机体解毒上具重要功能。研究采用RT-PCR和RACE法对剑尾鱼P-gp基因进行克隆并获得了全长cDNA序列4301 bp,该基因编码1286个氨基酸残基,估算编码蛋白的分子质量为141.64 kD。生物信息学分析表明,剑尾鱼P-gp不含信号肽序列,具ATP转运家族蛋白的典型结构域,包括2个疏水性的跨膜区(Transmembrane domains,TMD)和2个位于细胞浆内的核苷酸结合区(Nucleotide-binding domains,NBD),为全转运子,每个跨膜区都有6个跨膜α螺旋,而每个NBD包含1个ABC转运体家族标记序列;跨膜性质预测结果显示该蛋白属膜蛋白,具P-gp的典型特征。序列同源性分析发现,不同进化地位动物P-gp存在高度同源性,显示P-gp在系统进化上高度保守。P-gp在剑尾鱼肝脏、肾脏、脑等不同组织均有表达,其中以肝脏的相对表达量最高,是P-gp检测的代表组织。QRT-PCR实验表明,苯并(a)芘胁迫可明显诱导P-gp mRNA的表达。剑尾鱼P-gp的表达水平或可作为一个生物标记物指标,应用于环境持久性有机污染物的监测研究中。

登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建

运用OL PCR(OverlapPCR)方法 ,扩增出D2 0 4和D2 MON5 0 1结构蛋白区、5′非编码区等区域的嵌合片段 ,以此片段替换 pDVWS5 0 1质粒中的相应部分后 ,转化DH5α菌。测序结果表明 ,已成功构建含有D2 0 4株完整的PrM和E基因、一部分C基因 ,及D2 MON5 0 1株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cD NA(QH 0 4/MON5 0 1)克隆。为进一步研究登革

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。

利用交换接头技术构建大麦条纹花叶病毒新疆株RNA_2的全长cDNA克隆

本文采用双股交换接头(Crossover linker)技术对已建立的大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2 cDNA重组质粒pUBS_(112)进行修饰。使cDNA两端不必要的poly(dG):poly(dC)尾准确地缺失,同时补上了cDNA中相对于RNA_2 5’端区缺少的三个核苷酸TAA,并在cDNA末端插入了预定的限制酶切顺序。通过原位杂交筛选、酶切图谱分析、cDNA两端序列测定等手段,证明已获得BSMV-XJ RNA_2组分的全长cDNA克隆。

茶尺蠖小RNA病毒全长cDNA克隆的构建

为了初步研究茶尺蠖小RNA病毒(Ectropis oblique picorna-like virus,EoPV)的复制机制,从被EoPV感染致死的茶尺蠖幼虫中分离并纯化病毒粒子,提取病毒RNA,根据已公布的EoPV核苷酸序列,利用基因组上单一的酶切位点,设计特异性引物,应用RT-PCR扩增出5个覆盖全长的片段。随后采用融合PCR将5个片段拼接,最终将全长定向克隆到低拷贝质粒载体上,成功构建cDNA全长克隆p-EoPV。双酶切及测序鉴定证明全长克隆构建成功。与原序列比较发现,该克隆在氨基酸水平上有8个突变和1个缺失。本研究为深入探讨EoPV病毒生物学特性、病毒复制机理等奠定了基础。

庚型和丙型肝炎病毒的全长cDNA克隆在体内外的表达与复制(英文)

目的 :研究 HGV和 HCV的复制和表达。 方法 :利用 HGV全长 c DNA克隆 (HGVqz)及 HCV1 a/ 1 b嵌合体 c DNA克隆分别构建表达质粒 p3.1 HGV和 p3.1 HCV并转染张氏肝细胞 ,以 HGVqz克隆建立 HGV转基因小鼠。分别应用 RT- PCR、免疫组化及 Western印迹分析病毒正、负链 RNA,蛋白表达和剪切。结果 :在转染 p3.1 HCV的张氏肝细胞及 HGV转基因小鼠某些组织中可检出相应病毒的负链 RNA,但在转染 p3.1 HGV的张氏肝细胞中未能检出 HGV负链 RNA。Western印迹在转染 p3.1 HCV的张氏肝细胞中检测到针对 HCV NS3蛋白、相对分子质量约 70 0 0 0的特异性条带 ,在 HGV转基因小鼠某些组织中检测到 2条特异性条带 ,相对分子质量约 4 2 0 0 0和 1 0 0 0 0 0 ,分别相当于 HGV E2蛋白及其剪切中间体。然而 ,在转染p3.1 HGV的张氏肝细胞中检测到针对 HGV E2蛋白的特异性条带 ,其相对分子质量约为 31 0 0 0 0 ,相当于 HGV整个前体蛋白。结论 :HGV的表达与复制在体内、外存在差异。细胞内某些特异性因子在病毒前体蛋白剪切中起重要作用 ,HGV和 HCV前体蛋白剪切所需宿主因子可能存在差异 。

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长 ,采用了快速扩增cDNA末端 (RACE)、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合、非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆 ,结果得到了一致的全长cDNA ,三种不同实验方法的应用 ,为更方便。

马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中,建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12 704个核苷酸,与EAVBucyrus分离株的同源性为99.1%;全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly(A)下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2(nsp2)的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。

RACE技术及其在寄生虫全长cDNA克隆中的应用

PCR技术的出现大大提高了传统基因分离和克隆效率。以PCR为基础的RACE(rapidam plificationofcDNAends)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA的 5′和 3′端未知序列区域的方法。RACE技术被广泛应用于克隆全长cDNA 。

鸭坦布苏病毒基因组全长cDNA克隆构建与分析

根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)ZJ-407株全基因组序列设计并合成4对特异的Infusion引物,应用RT-PCR技术分4段扩增了DTMUV全基因组c DNA。通过In-fusion技术将扩增的c DNA重叠片段A,B,C和D片段分别克隆到载体p BluescriptⅡKS(+)中,获得了DTMUV全长基因组c DNA克隆p SK-T7-DTMUV。在扩增5'末端时,引入T7启动子序列;在基因组3'末段引入SmaⅠ酶切位点,以供c DNA模板的线性化之用。核酸序列分析表明,DTMUV毒株基因组全长为10 990个核苷酸,与DTMUV ZJ-407 DF-1细胞分离株的同源性为99.9%;全长基因组中有9个核苷酸发生突变,其中7处为沉默突变,2处导致相对应的氨基酸发生改变,且这两处均位于非结构蛋白NS5。结果表明,本研究成功构建了DTMUV ZJ-407株基因组全长c DNA,为其感染性c DNA的拯救奠定基础。