白蜡虫蜡酯合酶基因cDNA全长克隆及原核表达

白蜡虫（Ericerus pela）是我国特有的资源昆虫,泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状[1]。白蜡虫分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经济价值[2]。白蜡的主要成分是26酸26酯[3],已有研究表明,蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途径[4]。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶A还原酶催化脂酰辅酶A转化为脂肪醇,第二步由蜡酯合酶（WS）催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应[5]。

一条新的人肺腺癌耐药相关基因全长cDNA片段的克隆及序列分析

背景与目的:肺癌细胞的多药耐药(multi-drugresistance,MDR)是药物治疗失败的重要原因,但其机制尚未完全清楚。我们已经通过SSH发现了1条新的耐药相关基因片段,经检索GenBank,发现其与2001年4月公布的一条新的基因序列BC006151同源性高达99%。本研究旨在克隆该基因的全长,并检验该基因在几种肺癌细胞株中的表达,为进一步研究其功能和调控奠定基础。方法:根据BC006151基因序列设计引物,通过RT-PCR证实肺腺癌MDR细胞SPC-A-1/cDDP确实包含BC006151基因后,扩增该基因全长cDNA,通过测序对所得序列进行分析,并对其编码蛋白的氨基酸序列进行预测。应用半定量RT-PCR方法检验小细胞肺癌SH77、大细胞肺癌H460、肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1/cDDP等细胞株中该基因mRNA的表达。结果:成功克隆了BC006151基因的全长cDNA片段,长1298bp,它具有完整的阅读框和编码区,并与经SSH获得的片段有极高的同源性。该基因在MDR细胞株SPC-A-1/cDDP的表达明显高于其亲代细胞株;SPC-A-1表达高于H460,SH77未见表达。结论:BC006151基因是与cDDP致肺腺癌MDR密切相关的一条新基因。该基因全长cDNA片段的克隆将有助于阐明其在肺癌MDR发生中的作用。

SARS_CoV中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS-CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS-CoV的致病机制,将覆盖SARS-CoVBJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入VeroE6细胞,可观察到典型的SARS-CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS-CoVBJ01株原病毒序列一致。以针对SARS-CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度,结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS-CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)嗜好在PAM和其他单核细胞上生长 ,如果把PRRSV作为一种病毒活载体 ,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的免疫系统 ,更好地刺激机体产生免疫应答。本实验根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点 ,将PRRSV基因组设计为 8段进行了反转录和扩增 (RT_PCR) ,将得到的片段克隆到质粒pBluescriptIISK(_)或pMD 18T_vetcor中。在扩增 5’端时 ,运用 5’RACE获得了基因组 5’最末端序列 ,在亚克隆入pOK12前在 5’端上游引入了T7启动子序列。选取一个克隆在 3’端紧挨ORF7下游引入了PacⅠ位点 ,以期作为感染性分子克隆的分子标志。将扩增片段在pBuescriptIISK(_)中进行了部分连接后 ,亚克隆于低拷贝质粒pOK12中 ,在pOK12中进行了长片段的连接 ,并获得了基因组全长cDNA克隆。进行全基因测序后 ,在 3处发现有 6个核苷酸的缺失 ,运用插入突变修补丢失的碱基 ,最终获得了含有PRRSVCH_la株基因组全长cDNA的重组质粒pOKCH_laF和含有分子标志PcaⅠ的基因组全长cDNA克隆pOKCH_laPacIF。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒 (IBDV )浙江分离株 (ZJ2 0 0 0 )基因组 RNA为模板 ,采用 L ong- accurate RT- PCR(L A-PCR)一步法扩增并克隆了 IBDV ZJ2 0 0 0株基因组 A节段全长 c DNA。序列测定结果表明 ,克隆的 A节段全长共32 5 9个核苷酸 ,包括 5′、3′端的非编码区 (NCRs)和 2个部分重叠的开放阅读框 (ORF1和 ORF2 ) ,与参比的血清 型毒株核苷酸序列的同源性高达 95 .2 %～ 99.2 %。二级结构预测表明 ,在 5′- NCRs和 3′- NCRs存在 1个大型的茎环发夹结构。 ORF2编码 14 5个氨基酸的 VP5 ,与参比毒株的同源性高达 98.6 %～ 10 0 %。 ORF1编码 10 12个氨基酸的VP2 / VP4 / VP3,在氨基酸水平上 VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达 94 .9%～ 98.8%、96 .1%～ 98.5 %、97.1%～ 99.2 %。ZJ2 0 0 0共有 14～ 38个氨基酸的替代 ,其中特有氨基酸 6个 ,变异大多数集中在 VP2高变区 ,突变率达 2 .9%～ 11%。第 2个小亲水区内 2 80位氨基酸由 S替代了 N、2 90位 M替代了 L。这 2个突变可能与 IBDV的抗原性有关。VP2 - VP4剪切位点附近 5 11和 5 4 0位氨基酸的变异可能使 ZJ2 0 0 0株的毒力增强。分子系统进化树分析表明 ,ZJ2 0 0 0与欧洲 Cu- 1株、P2株、CEF94株和中国 Harbin株的关系最近 ,而与欧洲、香港、?

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。

新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析

将新城疫病毒SD强毒株的全基因组cDNA序列进行分段扩增,并将各个片段通过In-Fusion技术连于克隆载体pBR322上,获得了SD毒株的全基因组cDNA克隆。通过分段PCR扩增鉴定及全长测序分析,结果表明,SD毒株的全基因组cDNA克隆构建成功,并且成功引入T7启动子序列,全长基因组序列与亲本毒氨基酸序列的一致性为99.9%。单个序列比对发现,全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变,其中只有2处引起氨基酸序列发生改变;整个序列未出现基因的缺失、插入变化,因此全长氨基酸的位数未发生任何变化。SD毒株全长cDNA克隆的成功构建和序列分析为后续的反向遗传操作奠定了关键的技术基础。

正链RNA病毒基因组感染性克隆研究进展

综合叙述了构建正链RNA病毒基因组全长感染性cDNA克隆的基本思路和关键技术 ,并总结了影响基因组全长克隆感染性的因素 还简要介绍了利用正链RNA病毒基因组感染性克隆所取得的一些研究进展 。

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(TL2004)A节段cDNA的克隆及序列分析

用Long accurate RT-PCR(LA-PCR)的方法一步法克隆了IBDV TL2004基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明：克隆的A节段全长3260个核苷酸,包括5′、3′的非编码区(NCRs)和2个重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2%～99．2%。二级结构分析表明,在5′-NCRs和3′-NCRs各存在一个大型的颈环发夹结构。ORF1编码1 012个氨基酸的VP2-VP3-VP4,在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比Ⅰ型毒株的同源性分别达96．7%～99．6%、94．2%～99．2%、96．7%～99．6%。PRF2编码145个氨基酸的VP5,与参比Ⅰ型毒株的同源性高达95．9%～99．3%。TL2004在第2个小亲水区内279位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L,这2个突变可能是IBDV抗原漂变的原因。分子系统进化树分析表明,TL2004与欧洲Cu21株和中国JD1、Harbin株的关系较近,而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。

新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株全长cDNA克隆的构建与分析

为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pMD20-T载体中,建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择特异的酶切位点,将各个亚克隆产物逐段亚克隆入经过改造的低拷贝pOK12载体中,通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列及榔头锤酶基因置于病毒基因组的5′端,引入NotⅠ和FseⅠ将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列及戊型肝炎病毒核酶基因置于病毒基因组的3′端,结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12。测序结果表明,该毒株基因组全长15 319bp[不包括poly(A)尾];全基因序列比对结果显示,该毒株属于北美洲型毒株,与HuN4的同源性高达99.5%。测序及酶切鉴定结果证实,HP-PRRSV弱毒株基因组全长cDNA克隆已构建成功。