凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8.50×106CFU,重组率在95%左右,插入片断大小为0.5～4.0kb,多数在1.0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多(27.03%),与细胞骨架(13.51%)、细胞信号传导(13.51%)及代谢类基因(13.51%)共占67.56%。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息。

大黄鱼肌肉组织cDNA全长文库的构建及EST分析

以大黄鱼肌肉组织为材料,利用Creator Smart cDNA Library Construction Kit构建了大黄鱼肌肉组织的全长cDNA文库.文库质量分析表明:cDNA文库容量不低于1.68×106cfu/mm3,重组率达96%,插入片断的平均长度大于1 000bp.随机挑取512个cDNA克隆进行5’端测序,其中430条ESTs的长度大于100bp;并初步拼接得到了230个单基因簇(unigene),其中包括58个重叠群(contigs),172个单拷贝ESTs(singletons),冗余度为46.51%.经检索,35个ESTs在BLASTx上无明显的同源性(E值≤1.00×10-10),为新基因.195个ESTs与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的20.00%.蛋白质合成、细胞骨架和信号传导次之,比例分别为13.48%、12.17%、10.00%,其中包括高迁移率族蛋白B1、瘦素受体、β1-热激蛋白等.这些EST数据为进一步筛选和克隆大黄鱼肌肉特异性表达基因提供了平台.

应用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库

以甘蔗(Sac charum officinarum Linn)为材料,利用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库,从甘蔗叶片中提取总RNA并分离mRNA,用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链,通过长距离PCR扩增得到足量的双链cDNA,同时比较了不同双链cDNA与载体的连接效率和转化效率。结果表明,所构建的甘蔗叶片cDNA文库库容和重组百分比分别是1.8×106个克隆和98.6%,插入片段长度主要集中在0.6～2.5 kb,平均插入片段长度约为1.2 kb。本研究为国内首次报道甘蔗全长cDNA文库,所构建的文库拥有较好的质量,为项目组进一步开展甘蔗功能基因组学研究提供了平台。

几种全长cDNA文库构建方法比较

全长cDNA文库是高效、大规模获得基因全序列信息的一条有效途径,尤其是对基因组庞大、近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说,是一条开展功能基因组研究的重要途径。文章对几种全长cDNA文库的构建方法进行了概述,对各种方法的原理及优缺点做了分析、比较,并结合实验室的结果,重点介绍了Cap-trapper法在小麦全长cDNA文库中的应用及文库中全长基因比例判定方法。

亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序

目的构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库,为获取亚洲绦虫成虫的基因信息,建立基因表达谱,并为筛选疫苗基因和诊断抗原基因奠定基础。方法提取亚洲带绦虫成虫mRNA,构建pBluescript II SK全长cDNA质粒文库,测定扩增文库的滴度;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建文库的质量。随机挑选质粒文库转化的阳性重组克隆,进行较大规模的5′端测序,归并unigene。结果测定文库的滴度为1011pfu/μl,插入片段的大小主要在1000bp以上。共测1495个克隆,获得有效EST序列1126个,归并为643条unigene。结论已成功获得一高质量的亚洲带绦虫成虫全长cDNA表达文库,并获得了较丰富的成虫表达基因数据。

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。

大豆叶片全长cDNA文库的构建与鉴定

以大豆绥农14第一个三出复叶幼叶为材料提取mRNA，利用SMART技术合成了全长cDNA，经限制性内切酶SfiA和靳日消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR—LIB中，建成大豆叶片全长cDNA文库。文库容量1．2×10^6，重组率接近100％。对随机挑取的克隆进行菌液PCR鉴定，插入片断大小范围为0．25～2．0kb，主要集中在0．5～1．5kb，插入片断平均大小为0．9kb，这说明文库质量可保证大规模全长cDNA的获得。

利用改进的Oligo-capping法构建手掌参全长cDNA文库

Oligo-capping法是构建全长cDNA文库的重要方法之一.以名贵中药手掌参(Gymnadenia conopseaR.Br.)的幼芽组织为材料,通过减少mRNA的用量,用pUC18作载体,设计特异引物对第1链cDNA进行PCR扩增,按片段大小分级回收cDNA,形成了一种以Oligo-capping法为基础,构建珍稀材料全长cDNA文库的快速、简单的技术体系.利用该方法,首次成功地构建了手掌参的全长cDNA文库.经综合评价,文库容量达到了8×105个/μg cDNA,全长cDNA比例达到68%,重组率超过96%,说明本实验的改进非常成功.该文库的建成为手掌参的遗传资源保护和功能基因发掘等理论与应用研究奠定了基础.

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。

海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库的构建

以海岛棉品种 712 4黄萎病菌接种前后的根部组织为材料 ,构建的黄萎病菌诱导表达的全长c DNA文库。该文库的克隆数目为 1.15×10 7pfu,插入片段的大小在 0 .5～ 6kb之间 ,文库的阳性克隆子的比例为 84.7%。该文库可以用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究。在文中作者同时对棉花的文库构建所应该注意的事项进行了讨论。

利用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草(Ae.speltoides Tausch)全长cDNA文库

Captrapper法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。在引进、消化、吸收的基础上,通过设计引物,同位素检测,对末端转移反应条件控制等方面做了一些切实可行的改进,形成了一套简单易行的技术体系。利用改进的Captrapper方法,成功构建了小麦B基因组的可能供体种拟斯卑尔脱山羊草(Ae.speltoides)的全长cDNA文库。经综合评价,文库的全长比例达到89.6%,重组率为99%,库容量超过3.0×106cfu。

葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘，是昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模式种，本研究目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库，为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA，采用SMART技术合成全长cDNA，将限制性内切酶Sfi I消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR－LIB，转化入大肠杆菌（DH10B），获得原始文库。经过涂平板测定表明，原始文库的库容量为2．3×10^7个单克隆；随机挑取15个单克隆，通过PCR快速鉴定，插入片段大小在0．4～1．2kb之间，平均大小在0．9kb，重组率达100％。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛抗和克隆表达的建库要求。

日本对虾精巢和卵巢全长cDNA文库的构建

采用RDP试剂提取日本对虾精巢和卵巢的总RNA ,经Oligotex试剂盒纯化得到mRNA。根据SMART(switchingmechanismat5′endofRNAtranscript)技术 ,利用含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA第一条链 ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一条链在mRNA 5′端延伸出去的模板 ,采用LDPCR引物合成双链cDNA ,双链cDNA用SfiⅠ酶切和过柱分级分离后 ,与λTriplEx2两臂进行连接 ,随后进行λ噬菌体体外包装反应 ,构建成精巢和卵巢之全长cDNA文库。构建好的文库中 ,精巢的文库含有约 1 0 4× 1 0 6的重组子 ,卵巢的文库含有约为 1 2× 1 0 6的重组子。文库扩增后 ,滴度分别达7 3× 1 0 8(Pfu ml)和 9 1× 1 0 8(Pfu ml) ,插入cDNA长度为 4 0 0bp～ 3kb ,说明两文库均具有良好的质量 ,为进一步筛选、克隆精巢与卵巢特异表达基因奠定了基础。

葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有夏滞育的特性且与果蝇近缘.为构建葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库,并为进一步的夏滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础,利用RNAiso试剂盒提取葱蝇夏滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,限制性酶切消化后将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB.经鉴定原始文库的滴度为2.4×107cfu/mL.随机挑取克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.35～2.2kb之间,平均大小约为0.9kb,重组率达100%,获得了高质量的葱蝇夏滞育蛹cDNA文库.

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法 采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论 成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库。用SVTotal RNAIsolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA。扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMASPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E.coliDH5α内得到原始文库。经测定,构建的原始文库约含有2.56×106个重组子,插入片段多在0.5～2 kb之间,平均插入片段长度约1.1 kb,重组效率接近100%。结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功。

一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法

针对SMART方法中PCR扩增削减了大片段基因所占比例，使文库中很难获得大片段克隆的问题，进行了方法改进。在原始SMART方法的基础上，以大豆叶片为材料，通过琼脂糖凝胶分级分离技术，将PCR扩增后合成的dscDNA分成3个等级，分别与载体连接、转化，构建相应亚库，每个亚库容量在1．0×10^6左右，重组率接近99％。改进方法所建文库的平均全长率53．6％，与改进前的（52．2%）相当。插入片段范围为0．5～3．5kb，最大插入片断长度比改进前的提高1．5kb。该方法提高了SMART方法中大片段克隆的获得率，为大豆功能基因组学研究提供了保障。

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料，根据SMART^[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法，提取叶片总RNA合成cDNA，连接到质粒载体pDNR—LIB上，采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，构建了石蒜叶片全长cDNA文库。文库质量鉴定结果表明：文库滴度为1．15×10^6PFU／ml，重组率99．17％，插入片段大小多为0．5～2．0kb，1，0kb以上的占60％。

三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库构建及EST初步分析

三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive prote in-1、profilin和m asquerade-like prote in,且4个免疫相关基因共有48个克隆,占测序总克隆的68.6%,表明血细胞中免疫相关基因表达非常活跃。研究结果证实,构建血细胞全长cDNA文库是大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因的可靠途径,并为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。

利用SMART技术构建珙桐叶片全长cDNA文库

以珙桐叶片为研究材料，用Rneasy Plant Mini Kit提取珙桐叶片组织总RNA，反转录成单链cDNA，长距离PCR方法合成双链cDNA；PCR产物经蛋白酶K消化、SfiI酶切后，采用CHROMA SPIN-400柱分级分离，回收0．5kb以上的cDNA组分，以λTriplEx2载体连接并进行体外包装，构建了珙桐叶全长cDNA文库．结果表明：以XL1-Blue、BM25．8为受体菌测定的原始文库滴度为8．3×10^6pfu／mL，扩增后文库总滴度为4．16×10^8pfu／mL，重组率为97．3％；对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，表明插入片段大多分布在0．5～2．0kb之间，文库质最较高．这为进一步开展珙桐EST测序分析、目的基因克隆及功能基因组学研究奠定了基础．