光生物素标记的口蹄疫病毒cDNA探针的制备及其对口蹄疫病毒RNA检测的试验研究

本文首次报道了利用pF1034质粒制备FMDV O型特异性探针,并通过PCR反应扩增FMDO_1K株病毒基因组的第2962位与3071位之间共110bp序列,制备了能检测O型、A型和亚洲I型FMDV RNA的群(组)特异性探针。用硝酸纤维素膜斑点杂交试验表明,二者均能检测出10pg水平的O_9K毒株的纯RNA;但前者只与O型FMDV RNA杂交,与A型及亚洲I型FMDV RNA无交叉杂交现象;而后者则能与O型、A型和亚洲I型的FMDV RNA发生杂交反应。对照试验显示:此两种探针与SVDV ssRNA、BTV dsRNA、EHDV dsRNA、DHV ssRNA、PRV DNA、乳鼠组织细胞RNA、BHK_(21)克隆13细胞RNA及DNA等均不出现交叉杂交现象,但与IBR DNA有假阳性杂交反应。

地高辛标记cDNA探针组织及细胞mRNA原位杂交技术

地高辛标记ｃＤＮＡ探针组织及细胞ｍＲＮＡ原位杂交技术＊杜卫东周晓虹马学玲吴浩翟为溶张月娥＊国家自然科学基金重点项目和国家教委博士点专项基金资助课题作者单位：上海医科大学病理学教研室２０００３２（第一作者现工作单位：中国科学院上海生理研究所２０００３１...

地高辛标记的cDNA探针检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯Y病毒

根据已发表的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,分别以提取的TMV、CMV和PVY侵染的病叶总RNA为模板,反转录PCR进行体外扩增,分别得到长度为0.44、0.77、0.80 kb的目的片段,并克隆到pGEM-T easy质粒载体上,以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的双链DNA探针。以合成的探针通过斑点杂交技术检测烟草病叶总RNA和烟草病叶汁液。TMV、CMV和PVY的3种地高辛探针检测各自感染的烟草病叶总RNA的稀释低限分别为1:1 000、1:10 000、1:320,检测各自侵染烟草病汁液的最大稀释倍数分别为1:100、1:100、1:10,而每种探针与健康烟草和其它2种病毒的反应均为阴性。

地高辛标记的cDNA探针检测GM-CSFm RNA表达

采用随机引物法对人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ 探针进行地高辛标记，核酸分子原位杂交技术对人胸腺细胞、骨髓基质细胞、白血病细胞株（ＨＬ－６０，Ｋ５６２）、脐血细胞和胎肝组织的ＧＭ－ＣＳＦｍ ＲＮＡ的表达水平进行检测。结果表明：地高辛标记的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ 探针使用简便、灵敏度高、特异性强、杂交结果直观，探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。

地高辛标记cDNA探针检测苹果茎痘病毒

Partial sequence(314 bp) of ASPV was cloned and used as a probe labelled with digoxigenin-11dUTP.The total RNA extracted from samples with Apple stem pitting virus and a series of dilutions of plasmid with ASPV-cDNA were detected by dot blot hybridization.The results showed that the probe was sensitive and specific.The probe couldn’t hybridize with total RNA of Apple stem grooving virus,Apple mosaic virus and Apple chlorotic leaf spot virus samples as well as negative control,only hybridized with that extracted from dormant shoot infected with ASPV.The sensitivity for detection of plasmid contained ASPV-cDNA was 1.64 μg.

葡萄茎痘伴随病毒cDNA探针检测技术研究

选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的全球红葡萄品种,以葡萄叶片、皮层作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830 bp的预期目的片段,并将其克隆测序,其同源性与NCBI中的相关序列的同源性达96%。利用克隆质粒合成了生物素标记的GRSPaV的cDNA探针,在此基础上,研究了影响GRSPaV斑点杂交的因素,结果表明当探针浓度为200 ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应4 h,可获得较高灵敏度。

人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达

目的 :探讨SeP基因与肝脏疾病特别是肝癌发生发展的关系 .方法 :采用美国Georgia大学惠赠的质粒PBluescript HumanSelenoproteinP,用PCR法制备人SePcDNA探针 ,检测了 13例正常肝脏、2 0例肝硬化、30例肝癌组织中SePmR NA的表达水平 .结果 :PCR产物经电泳鉴定与预期相符 .3种肝脏组织的组织间质均有SePmRNA表达 ,主要位于脉管区的血管内皮 ;正常肝细胞、肝硬化肝细胞及肝癌细胞中SePmRNA阳性率分别为 84 .6 % ,5 0 .0 % ,2 0 .0 % .肝癌细胞阳性表达率明显低于其他两组 (χ2 =15 .84 ,P <0 .0 0 5 ;χ2 =4 .96 ,P <0 .0 5 ) .正常肝细胞和肝硬化肝细胞的胞质及胞核内均出现蓝色的阳性颗粒 ,在胞核主要分布在核仁与核周 ;正常肝细胞的核阳性强于肝硬化肝细胞 .HCC细胞阳性表达颗粒位于胞质 ,胞核几无表达 .结论 :人SePcDNA探针制备成功 ,可用于人体组织SePmRNA的原位检测 .肝癌细胞中存在SePmRNA的表达缺失 。

应用Digoxigenin标记的cDNA探针检测香蕉束顶病毒

用非放射性的Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１１－ｄＵＴＰ取代３２Ｐ标记的ｄＡＴＰ或ｄＣＴＰ，标记克隆的ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂｃＤＮＡ，制备成探针．通过核酸斑点杂交对粗提取的ＢＢＴＶ，ＢＢＴＶ－ＤＮＡ，感染ＢＢＴＶ的香蕉植物的拟茎，球茎处的组织，新生叶片以及成熟后的叶片进行了检测．结果表明：ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１ｃＤＮＡ探针特异性强，不与ＣＭＶ—ＲＮＡ、无毒香蕉组培苗提取的核酸发生杂交反应；仅与粗提ＢＢＴＶ、ＢＢＴＶ－ＤＮＡ、ＢＢＴＶ侵染的香蕉组织的核酸提取物发生杂交反应．此探针灵敏度高，可检出含有ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂ的质粒ＤＮＡ的最小量为１０ｐｇ；测定感病香蕉植株的拟茎汁液的最高稀释度可达１∶１２８，相当于０．４ｍｇ病蕉组织中的病毒含量．测定同一病株不同部位的结果表明，ＢＢＴＶ在植物体内的分布不均匀，拟茎处组织中病毒含量最高，球茎处的组织以及新生叶片中的病毒含量次之。

生物素标记的6种cDNA探针检测H22、EAC及其克隆细胞株mRNA的表达

目的 检测H2 2、EAC瘤细胞及其克隆细胞株mRNA的表达。方法 用生物素标记的 6种cDNA探针 ,细胞玻片原位杂交的方法。结果 H2 2与生物素标记的 4种探针杂交阳性 ,其克隆细胞株H2D8、H2G4分别与 3及 1种探针杂交阳性 ;EAC细胞株与 4种探针杂交阳性 ,克隆细胞株E2G8与 2种探针杂交阳性 ,E2C6克隆细胞株与 6种探针杂交均阴性。

库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对 2种总RNA提取方法进行了比较研究 ,从中行筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法 ;并利用RT PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针 ,在此基础上 ,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了试验研究 ,结果表明 ,当探针浓度为 4 0 0ng·ml-1,甲酰胺浓度为 4 5 % ,4 2℃杂交反应 6h ,可获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好 ,基本无背景。Tween2 0的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测 ,结果表明 ,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号 。

生物素标记GFV－cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用

以整合到质粒中的ＧＦＶ－ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ合成了生物素标记的ＧＦＶ单、双链探针。用合成的探针对提纯的ｃＦＶ－ＲＮＡ＿２、感染ＣＦＶ的昆诺藜叶及１８株而萄进行ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交检测表明：检测提纯病毒ＲＮＡ＿２的灵敏度为１．５ｐｇ／斑点，感染ＧＦＶ的昆诺藜提取液最高稀释度可达４０９６０倍；１１株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性，且汁液稀释４００～８００倍仍能测出，７株不显示典型扇叶症状的葡萄中３株受到ＧＦＶ的侵染。单、双链探针最适使用浓度分别为１／２００及１／１００。

生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达

目的 检测S180及其克隆细胞株S1B11及S2D9mRNA的表达 ,对这些细胞株进行识别和质量控制。方法 用生物素标记的 6种cDNA探针 ,细胞玻片原位杂交的方法检测细胞中mRNA的表达。结果 北京市肿瘤研究所 (肿瘤所 )保存的S180与生物素标记的P16、c fos、c myc及c jun探针杂交阳性 ,克隆细胞株S1B11与c fos及c jun探针杂交阳性 ,克隆细胞株S2D9与c fos、c myc及c jun探针杂交阳性。结论 肿瘤所S180及其 2株克隆细胞中mRNA的表达不同 ,c myc基因的表达与否可以把S1B11及S2D9克隆细胞区别开 ;

EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备(英文)

目的设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用.方法cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全 EBV基因组探针,它们的长度被定在300～600 mer并且具有高度特异性.从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和 RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体.所有的探针被测序鉴定.结果除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRFl基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆.结论EBV cDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础.

逆转录制备cDNA探针对人胃癌MGC80—3细胞系多种癌基因转录的同步检测

本文报道利用人胃癌MGC80-3细胞系总polyA ^+RNA,逆转录制备cDNA探针,并与多种克隆癌基因的质粒DNA斑点杂交,同步检测倍增生长的人胃癌MGC 80-3细胞系不同原癌基因转录本的丰度。结果发现,V-sis、c-erbB-2、V-abl、H-ras、K-ras和c-myc质粒DNA的斑点出现阳性杂交信号,其中V-sis、c-erbB-2的斑点信号最强。说明人胃癌MGC80-3细胞系中,多种原癌基因协同地进行表达。

影响地戈辛标记cDNA探针检测prET_(-1)mRNA原位杂交效果的因素探讨

影响地戈辛标记ｃＤＮＡ探针检测ｐｒＥＴ－１ｍＲＮＡ原位杂交效果的因素探讨①华西医科大学附属第一医院（６１００４１）陈明②黄颂敏刘聪地戈辛标记探针的原位杂交是利用地戈辛配基作为标记物，非放射性检测特异性ＤＮＡ或ＲＮＡ序列的一种分子生物学技术，可特异判别...

3种梨树病毒cDNA探针检测

利用Biotin-16-dUTP标记的cDNA探针分子杂交检测分析了新疆梨树上的3种主要病毒(梨环纹花叶病毒、梨脉黄病毒、苹果茎沟病毒)并优化了杂交反应体系。结果表明,这3种病毒探针的检测灵敏度分别为5、10和10 pg。用文中的方法提取的RNA均能在10-3稀释后显色。该方法与RT-PCR方法对样品带毒状况的检测结果一致。

人骨形成蛋白-2的cDNA探针的实验合成

目的利用分子生物学实验技术合成并标记人骨形成蛋白-2(hBMP-2)的cDNA探针。方法从人髁状突骨折标本中提取总RNA,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出hBMP-2成熟肽编码区基因的cDNA片段,将其插入pGEM-T质粒中,并转化到大肠杆菌;挑选阳性克隆培养,提取重组质粒,并作核苷酸序列分析;用限制性内切酶单酶切后,再经地高辛标记检测试剂盒随机引物法标记,合成地高辛标记的BMP-2cDNA探针;利用这一探针作人颌骨成骨性骨肉瘤标本中BMP-2mRNA表达的原位杂交研究,以鉴定探针的可靠性。结果通过实验方法合成了hBMP-2cDNA探针,利用这一探针的原位杂交研究证实颌骨成骨性骨肉瘤中有BMP-2mRNA表达。结论自行合成并标记的人BMP-2cDNA探针,性状稳定、可靠,能够应用于BMP-2mRNA表达的原位杂交研究。

BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及其cDNA探针的制备

目的提取、克隆BALB/c小鼠乳糖酶基因L ac,了解其序列及所编码蛋白的属性,并制备L ac cDAN探针,为进一步研究乳糖不耐受奠定基础。方法取4周龄BALB/c小鼠小肠组织,用T rizo l试剂盒提取总RNA,经RT-PCR、梯度PCR获取L ac cDNA。测序鉴定后将序列提交NCB I G enB ank,同时利用生物信息学,对其编码产物进行预测。探针的制备采用随机引物法以地高辛标记。结果所获得的L ac cDNA编码区有912 bp,编码303个氨基酸残基,在其二级结构中存在一个糖苷键水解酶基序,C-末端有一疏水螺旋区。标记后的探针经检测,灵敏度达到1 pg/μl。结论所获得的L ac基因经鉴定确为乳糖酶基因,由它编码的蛋白产物是乳糖酶。标记的探针灵敏度很高,可以用于原位杂交实验。

生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒

以含苹果锈果类病毒(ASSVd)全长序列的重组质粒PUC为模板DNA,加入ASSVd类病毒特异性引物,应用聚合酶链式反应技术(PCR)合成了生物素标记的cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针最适使用浓度为1/10,探针检测感病的ASSVd类病毒的最大稀释倍数是1/100。利用制备的探针进行田间检测,结果与RT-PCR检测结果一致,阴性对照均无杂交信号出现。

库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。