重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肿瘤抗原的研究进展

1995年Sahin等首先建立了重组cDNA表达文库血清学分析法 (SEREX)以来 ,大量的人类肿瘤抗原被发现和鉴定 ,并建立了SEREX技术合作组及相应的数据库。

干旱诱导的甘蓝型油菜SSH文库及抗旱相关基因表达的分析

从前期构建的干旱诱导的甘蓝型油菜SSH文库中随机挑取了646个阳性克隆,对其进行测序及生物信息学分析。结果表明:通过测序,获得639条高质量EST序列,186条单一序列(重叠群89条,单拷贝序列97条);比对分析发现,166条单一序列有同源序列;乙醛酸和二羧酸代谢、碳代谢、光合中的碳固定、氨基酸的生物合成、氮代谢等在植物抵抗干旱胁迫中发挥着重要的作用;MYB、NAC5、锌指蛋白等转录因子以及苹果酸脱氢酶、核酮糖1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶、果糖–1,6–二磷酸醛缩酶、磷酸核酮糖激酶等与光合相关的基因以及P5CS基因、F–box蛋白等参与油菜干旱胁迫应答;单一序列涉及的功能中所占比例较大的是蛋白绑定和催化活性。以抗旱性较强的甘蓝型油菜Holiday为材料,在开花初期进行干旱处理,在处理的第1、3、5、7天(土壤含水量分别为60%、40%、30%、20%)进行叶片取样,采用实时荧光定量PCR,分析基因表达量,发现随机选取的文库中的3个基因(P5CSb、BnSOS2和CAM)在干旱胁迫下表达水平均上调,推测这3个基因在抵御干旱胁迫中发挥了重要作用。

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因。方法采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。结果成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42×106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0kb之间。文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。结论应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子。

肺癌候选抗原的血清反应分析及其联合检测的应用

目的:通过重组cDNA表达文库血清学分析(SER-EX)技术筛选鉴定的5种肺癌候选抗原的血清学反应及其联合检测分析,对其能否作为肺癌早期诊断的血清学标志物进行评价,并提供一个肺癌早期诊断的新方向.方法:采用重组克隆抗原表达技术扩增5种肺癌候选抗原[分别是X5:二羟基苯甲酸内脂结合蛋白1配偶体(POB1);X18:DNA拓扑异构酶Ⅱα(Top2A);X44:中枢神经系肽酶Ⅰ(TPP1);X48:热休克蛋白90а(HSP90а);X52:真核翻译延长因子1γ(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma)],免疫印迹法检测肺癌患者血清、正常人血清中自身抗体的反应,流行病学方法对其检测结果进行评价.结果:POB1,Top2A,HSP90а3个肺癌候选抗原克隆在肺癌患者血清和正常人血清中的相应IgG抗体阳性率差别有统计学意义(P<0.05);3个阳性反应抗原抗体反应联合分析时,能够在保持特异度等基本不变的前提下,明显提高诊断肺癌的灵敏度,具有较大的临床诊断价值.结论:3个抗原可作为肺癌的早期诊断的候选标志物,为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向.

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的：筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原。方法：5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析（SEREX）技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析。结果：①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300-2800bp。②测序70个阳性克隆代表63个不同的基因。③生物信息学分析1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论：使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原。

系统性红斑狼疮血管炎相关自身抗原的血清学筛选

目的通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得系统性红斑狼疮(SLE)血管炎相关自身抗体所对应自身抗原的cDNA序列。方法收集SLE病人血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选人微血管内皮细胞(HM VEC)cDNA文库。结果通过两轮筛选获得11个阳性克隆。通过生物信息学分析发现这11个阳性克隆cDNA序列编码三种不同的自身抗原,分别为SSA、SSB和YB-1。其中YB-1尚未被报道过与SLE血管炎相关。结论首次发现YB-1与SLE血管炎相关。通过SEREX技术,我们可能找到有助于SLE诊断、治疗和判断预后的自身抗原。

肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选

目的筛选肺癌抗原组中强免疫原性抗原,以期为肺癌的早期诊断、疫苗研制提供参考。方法选取5份异体肺癌患者血清以重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术筛选肺癌cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。此外,选取2017年2月至2018年2月收治的肺癌患者60例为肺癌组,另取同期进行体检的正常人员60例为对照组。分别采集两组人员血清标本,对比相关肺癌抗原的异体血清反应结果。并对差异有统计学意义的肺癌抗原进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,明确其在肺癌早期诊断中的价值。结果本实验共完成3轮血清学筛选,最终得到70个阳性克隆。采用NCBI网上序列分析软件BLAST对各cDNA序列的同源性进行比对,结果显示上述70个阳性克隆分别表示63个不同基因,包括35个已知基因、26个功能未知基因以及2个新基因。其中35个已知基因中仅有DNA拓扑异构酶Ⅱα(Top2A)基因与肺癌相关,2个新基因分别为热休克蛋白90α(HSP90α)、真核翻译延长因子1γ(EF-1γ),功能未知基因中可能与肺癌相关的包括二羟基苯甲酸内置结合蛋白1配偶体(POB1)、中枢神经系肽酶Ⅰ(TPP1),共5种肺癌相关抗原。肺癌组Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆的IgG血清抗体阳性率高于对照组(P<0.01)。Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆联合检测诊断肺癌的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述三项指标单独检测(P<0.05)。结论SEREX技术可用于肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选、鉴定,临床工作中可将Top2A、HSP90α、POB1基因作为肺癌早期诊断以及免疫治疗的靶向基因。