cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.

RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以...

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。

cDNA末端快速扩增技术及其方法的改进

cDNA末端快速扩增(RACE)技术可以快速扩增mRNA3'和5'末端,从而获得全长的cDNA序列,为分离和研究新的基因提供了一个快速简便的方法。从RACE的原理出发,综述RACE技术的优缺点,阐述RACE技术的改良,并对其应用现状和发展前景进行了分析。

一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA3′末端序列(英文)

根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端。与常规的 3′RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

利用Y-RACE法进行棉花胚珠cDNA末端快速扩增

在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次cDNA合成就能进行多个基因的 3′和 5′末端的扩增 .分别利用Y RACE方法和RACE试剂盒 (TaKaRa)扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的末端序列 .序列比较表明 ,用Y RACE方法扩增的末端序列较试剂盒所得序列在最末端稍短 ,但同样能进行正确拼接并获得全长编码序列 .对Y RACE法的优缺点和可能的改进作了进一步讨论 .

一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA ,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物 ,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法 (SMARTRACE)扩增该EST的 5′末端 ,并进行克隆测序 ,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后 ,获得了三个新的全长cDNA。结果表明 ,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。

cDNA末端快速扩增试剂盒研发进展

DNA扩增的方法有许多种,其中cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)因其操作简单、成功率相对较高、重复性好,被广泛应用于真核生物基因全长的克隆与分析。本文比较了市售的RACE试剂盒所采用的模板制备策略及改进的扩增方法。

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

基于cDNA末端快速扩增的刚地弓形虫核仁G蛋白-1的克隆

目的 克隆弓形虫核仁G蛋白- 1(NOG1)基因的全长cDNA序列。方法 根据NCBIGeneBank中登录的弓形虫NOG1基因的唯一EST序列设计引物,利用cDNA 5’-末端快速扩增法(5’-RACE)和cDNA 3’-末端快速扩增法(3’-RACE)分别对已知序列进行延伸,将扩增获得的3’-端和5’-端未知序列与位于中间位置的已知序列进行拼接,然后经Blast检验全长序列的正确性。结果 5’-RACE扩增获得3个不同长度的片断,最长片断全长12 87bp ,去除引物和夹杂的已知序列后,通过5’-RACE在5’端扩增获得未知序列为1196bp。3’-RACE扩增后得到一条特异性条带,位于大约1.7kb左右,测序全长为16 34bp ,去除引物和已知序列,经3’-RACE扩增获得的3’-端未知序列为12 0 4bp。Blast全长为316 7bp的3段拼接序列,发现其覆盖NOG1基因cDNA的完整ORF或者CDS序列(6 5 0bp 2 80 9bp)。推导翻译出的蛋白质一级结构包含719个氨基酸(aa) ,在所有已发现物种的NOG1中,弓形虫NOG1基因的cDNA和相应的aa序列都是最长的。该序列已登录NCBIGeneBank ,核酸序列登录号AY6 86 734,对应蛋白质的aa序列登录号为AAT94 2 90。结论 本研究首次克隆获得了弓形虫NOG1基因的全长cDNA序列,并对相应的aa序列进行了推导翻译和简单分析。

cDNA末端快速扩增法克隆高山离子芥原叶绿酸酯氧化还原酶基因及其表达特异性分析

用cDNA末端快速扩增技术从高山离子芥中克隆得到完整的原叶绿酸酯氧化还原酶(POR,EC:1.3.1.33)基因,命名为CbPORB,DNAMAN软件分析CbPORB和其他几种植物的POR基因,有很高的同源性,将其cDNA序列提交到NCBI数据库(序列接受号为FJ390503)。CbPORB基因全长1444bp,包含1个1209bp的开放阅读框(ORF),编码402个氨基酸的蛋白CbPORB(序列号为ACJ12925)。NCBI数据库在线软件计算高山离子芥CbPORB蛋白的等电点为9.43,推测其相对分子量为43.37kD。组织特异性表达分析显示:CbPORB在叶、茎中表达,根中不表达,具有器官特异性;干旱胁迫处理抑制CbPORB的转录水平;而表油菜素内酯(24-epibrassinolide;EBR)处理提高了CbPORB的转录水平。

扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究

目的应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法。方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA。根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析。结果采用改良5′RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因。结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因。应用改良5′RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性。

丙型肝炎5'非编码区末端快速基因扩增方法的建立及应用

目的建立快速获得丙型肝炎(HCV)基因组5非编码区(5 UTR)真末端序列的分子生物学方法。方法逆转录后利用末端聚合酶(TDT)进行加尾反应,再利用套式聚合酶链反应(PCR)扩增出目的末端基因的cDNA片段,A-T克隆,用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)与PCR鉴定重组子,全自动序列分析仪测定插入子序列。结果cD-NA末端快速扩增技术(RACE)获得5株HCV5 UTR克隆,包括3株全长克隆和2株缺失克隆。2株缺失克隆,一条在5末端缺失53个碱基,另一条缺失144个碱基。结论RACE技术快速、有效、实用,可有效获得丙型肝炎病毒基因组的5非编码区末端序列。

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶd型新城疫病毒基因组末端序列及分析

【目的】简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)流程,测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶd型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析。【方法】利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和cDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增。【结果】建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV3’末端leader和5’末端trailer序列比对分析。【结论】本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5’端trailer与3’端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变。通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3’末端形成一个发卡结构。JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3’-UCUC-5’,与基因组3’端发卡环的3’-UCUUA-5’相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度。

由EST到全长cDNA——RACE及相关技术进展

由EST出发获得全长cDNA是基因组和功能基因组研究的重要内容之一,cDNA末端快速扩增技术(RACE)是实现此目的的重要方法。本文对RACE的基本原理及其改进,尤其是AM-MV酶TS(template switch)功能的应用带来的技术革新进行了综述。

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo(+)和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo(+)载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)

利用RACE技术和生物信息学资源快速钓取多个侯选同源基因

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌癌旁和正常组织表达量高的EST W12 3,通过与GenBank的dbest库进行电子杂交 ,选取了与W12 3同源度高的若干EST ,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物 ,利用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术得到了 7条带有polyA尾的 3′EST ,进行序列分析后 ,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST ,且具有共同的保守序列 ,已登录GenBank。

cDNA末端快速扩增技术新进展

全长 c DNA的获得是基因克隆的重要内容 ,也是目前人类基因组研究中的一个重要方面。 c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是以 PCR为基础 ,从部分已知的 c DNA序列扩增出其他未知部分的 5′端和 3′端的 c DNA序列的一种方法。本文从 RACE技术的基本原理方法出发 ,详细阐述了其存在的缺陷 ,并对 RACE最新研究进展 ,如 Marathon- PCR、Smart- RACE以及“电子”c

严重烧伤F344大鼠免疫细胞中一个EST全长序列的扩增

目的 :探讨免疫细胞在大面积烧伤后全身免疫功能紊乱中的变化 ,对F344大鼠烧伤后血液淋巴细胞和单核细胞中的 1个差异表达基因片段 (AI764697 1 )进一步研究。方法 :根据该片段核苷酸序列设计双向引物和巢式引物 ,应用cDNA末端快速扩增技术 (SMARTRACE)对该片段进行双向扩增 ,扩增后结果经测序 ,用Northernblot杂交验证。结果 :设计的两对引物经扩增都得到了产物 ,克隆测序后得到 1条长度为 592bp的片段。Northernblot杂交在烧伤后得到 1个长度约 70 0bp的产物 ,在脾脏中表达水平较高 ,与RACE结果符合。该核苷酸序列已得到Gen Bank登录号AF2 4 4 895。结论 :在严重烧伤F344大鼠的血液淋巴细胞和单核细胞中分离并扩增出一个新的基因全长序列 ,其来源。