利用Taq DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用ＴａｑＤＮＡ聚合酶（ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）直接对ＲＮＡ进行反转录成ｃＤＮＡ第一链，然后用特异引物进行ＰＣＲ扩增，结果表明，反转录达到ＡＭＶ逆转录酶的效果，且可能得到比ＡＭＶ逆转录酶更完整的ｃＤＮＡ第一链。

条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cDNA质粒文库的构建和鉴定

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含HindIII酶切位点的Oligo(dG)10为引物,通过LD-PCR (long- distance-PCR)方法合成双链cDNA,将双链cDNA经BamHI和HindIII双酶切,通过T4DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库.对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cDNA文库容量至少为4.92×105个/μg dscDNA,重组率达96.7%.对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中25个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76%).鲨鱼再生肝组织cDNA文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础.

三肽囊素抗独特型抗体可变区基因库的建立

利用抗bursin单克隆抗体免疫SPF来航鸡 ,获得抗独特型抗体的产生细胞 ,从中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,根据鸡抗体重、轻链基因设计引物 ,进行PCR扩增。在体外成功地扩增出该抗体的可变区重链和轻链基因。