从卵巢癌cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因的研究

目的利用肿瘤患者自体血清筛选患者肿瘤cDNA表达文库SEREX,寻找肿瘤特异性抗原是肿瘤免疫学研究的新策略,由此方法所获B细胞抗原肽可为进一步寻找T细胞抗原肽,开展肿瘤免疫治疗和诊断提供线索。方法采用SEREX方法,筛选中国人卵巢癌cDNA表达文库。对获得的阳性克隆片段测序鉴定和进行BLAST同源性比较。采用RTPCR,分析正常组织和肿瘤组织及肿瘤细胞株中6个新的EST片段的表达。结果所获基因片段大多数为已知抗原基因20/27。根据其来源又可归类为结构基因、线粒体基因和调控基因。另外,获得6个未知的EST片段。RTPCR的结果表明,4个ESTEST8788、1750、1754和3533片段在肿瘤和正常组织中均有表达,2个EST在正常组织中未见表达,而在肿瘤组织中有表达,可能是与肿瘤相关或特异的EST片段。结论SEREX方法不失为一种有效筛选卵巢癌肿瘤抗原的新方法,所获肿瘤抗原候选基因,可进一步进行结构和功能的研究。

平颏海蛇毒腺cDNA表达文库的构建

以真核表达载体质粒pcDNA3为载体 ,成功构建了一个高质量的平颏海蛇毒腺cDNA表达文库 ,这是国内首个海蛇cDNA文库 .通过对亚文库克隆的大规模序列测定和分析 ,发现了 38个海蛇新基因序列 ,其中包括神经毒素基因、磷酸脂酶A2 基因和半胱氨酸丰富毒蛋白基因共 10个编码海蛇毒素蛋白的新基因 .

赤魟尾刺cDNA表达文库的构建

目的 以赤尾刺为出发材料 ,构建以真核表达载体pcDNA 3 0为基础的赤尾刺cDNA表达文库。方法 应用SMARTTMcDNALibraryConstruction技术和初步生物信息学分析等方法。结果 通过对亚文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,已获得了 5 6个赤新EST序列 ,其中已确定的全长cDNA克隆有 2 4个 ,包括IPL肿瘤抑制因子、亲环素cyclophilinA、硒蛋白selenoproteinW、半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatinA、tyrosyl tRNAsynthetase和calcineurin类似物蛋白等。结论 这些基因在赤中绝大多数均为首次发现。赤尾刺cDNA表达文库的成功构建 。

人骨肉瘤9607细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的构建骨肉瘤9607细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件,最终从临床角度增加患者预后质量和开辟患者康复的新途径。方法从9607细胞中提取TotalRNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoRⅠ适配子连接,磷酸化EcoRⅠ适配子5’端,Sephacryl-S400柱除去小于400bpcDNA片段,和噬菌体λgt11(载体)连接,包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量倍比稀释后感染E.coliY1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段大小。结果建成含1.3×106重组子的骨肉瘤9607细胞cDNA表达文库,重组率93.5%,重组子插入外源片段不小于0.5kb,平均长约1.3kb。结论达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆,以开辟提高患者康复的途径。

华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

目的 构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30％左右,1kb～500bp占69％。结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库。

日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的构建和初步分析

以海洋生物日本鬼鲉毒腺为材料 ,应用SMARTTM cDNALibraryConstruction技术 ,构建以真核表达载体pcDNA3 0为基础的日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库 .通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,获得 94个日本鬼鲉毒腺新表达序列标签 (ESTs) ,其中已确定全长cDNA的克隆有 35个 ,包括溶细胞素基因、类短链神经毒素蛋白、C型凝集素、巨噬细胞迁移抑制因子、致病相关基因等 ,这些基因在日本鬼鲉中绝大多数为首次发现 .日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的成功构建 ,为深入研究日本鬼鲉毒腺的组分及其分子作用机理奠定了基础 .

猪囊尾蚴cDNA表达文库构建及抗原基因筛选

采用Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 试剂盒提取猪囊尾蚴ｍ ＲＮＡ；Ｔｉｍ ｅ－ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒反转录合成双链ｃＤＮＡ，并在末端加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩａｄａｐｔｏｒ，修饰后的ｃＤＮＡ 与λｇｔｌｌＥｃｏＲＩ臂连接，体外包装为λ噬菌体颗粒；感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０ 构建成功库容量为２×１０６、重组率为８０％ 的ｃＤＮＡ表达文库。利用兔抗猪囊尾蚴虫体抗原和囊液抗原血清分别对一部分文库进行免疫印迹筛选，分别获得８ 个阳性克隆。提取阳性克隆ＤＮＡ，利用ＰＣＲ法从重组噬菌体ＤＮＡ中扩增出ｃＤＮＡ片段，长度自４００—９００ｂｐ。本文工作为研制猪囊尾蚴核酸疫苗打下了基础。

应用cDNA表达芯片研究复方黄连对CNE1鼻咽癌移植瘤基因表达的影响

目的 :研究复方黄连对鼻咽癌裸鼠移植瘤基因表达的影响。方法 :培养的鼻咽癌细胞系CNE1细胞接种Balb/C裸鼠 ,待移植瘤形成后灌喂复方黄连 ,然后从移植瘤组织提取RNA ,经逆转录标记后的cDNA作为探针 ,与高通量cDNA表达芯片杂交并用激光共聚焦扫描仪分析基因表达。通过逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)半定量技术进一步分析差异表达基因的表达。结果 :复方黄连处理移植瘤裸鼠 30d后 ,移植瘤明显减小 ,其抑瘤率为 2 9.5 %。同时 ,移植瘤组织基因表达发生显著变化。用该复方处理的CNE1鼻咽癌移植瘤组织有 147条基因表达发生改变 ,包括 10 2条下调表达的基因和 45条上调表达的基因。RT PCR半定量技术分析证实有 3条基因为真正差异表达 ,它们分别是MAD3,H731和CHK1基因。其中 ,MAD3和H731基因表达上调 ,CHK1基因表达下调。结论 :复方黄连可抑制CNE1鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长并可影响其基因的表达 ,它对CNE1鼻咽癌移植瘤的抑制作用与其调节移植瘤基因表达密切相关。

恶性疟原虫(海南株)cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的 :构建恶性疟原虫 c DNA表达文库。方法 :采用“一步法”提取红内期恶性疟原虫12 2 4 μg RNA,经 Oligo( d T)纤维素柱纯化得到 35.84 μg poly ( A) +m RNA。取 10 μg m RNA反转录得到 1.75μg平端双链 c DNA,与含 Eco RI,Not I,Sal I酶切位点的衔接头连接后 ,经分级分离柱纯化回收到 2 0 0 ng大小主要在 50 0 bp- 7kb左右的 c DNA片段。取 50 ng c DNA与λgt11噬菌体臂连接后体外包装 ,完成建库。并采用 PCR方法初步鉴定该文库。结果 :已构建一个含 10 6个重组子的 c DNA表达文库。结论 :文库容量及插入 c DNA片段的大小适合于进一步研究。

从大肠癌组织cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因

目的利用肿瘤患者血清筛选大肠癌cDNA噬菌体表达文库,寻找肿瘤特异性抗原基因。方法采用SMART技术构建中国人大肠癌cDNA噬菌体表达文库。用SEREX方法筛选中国人大肠癌组织cDNA噬菌体表达文库。对获得的阳性克隆片段进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并对其生物信息进行分析。结果成功地构建了大肠癌cDNA噬菌体表达文库,原始文库含2.39×106个重组子,重组率达到97.5%,文库扩增后滴度达到4.1×1010pfu/ml。插入外源性cDNA片段的大小为0.5～4.0kb。SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知EST片段。根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等。结论利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因。

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的 构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。 方法 提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。 结果 未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。 结论 已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD

用长距PCR法构建恶性疟原虫cDNA表达文库

目的 构建恶性疟原虫cDNA表达文库。方法 用Trizol试剂盒提取总RNA ,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物 CDSⅢ引物直接用总RNA选择性地反转录成单链cDNA ,再用长距PCR(LD)方法选择性地扩增出双链cDNA ,经蛋白酶K消化和酶切后 ,用玻璃奶试剂盒回收 2 0 0bp以上DNA片断 ,经与载体λTriplEX2连接和蛋白抽提物体外包装后 ,构建成cDNA文库并对文库进行了初步的鉴定。结果 构建了高滴度 ,高重组率的恶性疟原虫cDNA表达文库。结论 所构建的疟原虫cDNA文库适合进一步筛选抗疟原虫药物结合蛋白基因。

青海血蜱幼蜱cDNA表达文库的构建及其保护性抗原基因的免疫学筛选

采用常规方法构建了青海血蜱幼蜱cDNA表达文库,初级文库的库容量为5.0×105PFU/mL,扩增后的库容量为8×109PFU/mL;用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清对该文库进行了免疫学筛选,对阳性噬菌体进行了亚克隆,提取质粒后转化宿主菌JM109,最终共得到幼蜱基因11个,分别命名为HqL1、HqL2、HqL3、HqL4、HqL5、HqL6、HqL7、HqL8、HqL9、HqL10、HqL11。测序分析表明,其中的6个为新基因。分析发现HqL7、HqL8、HqL9和HqL11具有较高的研究价值。

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。

青海血蜱cDNA表达文库的构建

在无RNA酶污染的环境下摘取半饱血青海血蜱唾液腺、马氏管和卵巢等器官,从中提取RNA,进而纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成青海血蜱的cDNA表达文库。经测定,所构建青海血蜱cDNA文库的库容量约为2×106PFU/mL,重组率为100%,扩增后文库的滴度为8×109PFU/mL。通过对该文库的免疫学筛选,获得一个编码青海血蜱肌球蛋白碱性轻链的全长cDNA序列。所有结果显示,青海血蜱cDNA表达文库已成功构建。

青海血蜱cDNA表达文库的免疫学筛选和阳性克隆的鉴定

为获得抗青海血蜱免疫原基因,用兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清和兔抗青海血蜱唾液蛋白阳性血清对青海血蜱cDNA表达文库进行了免疫学筛选,经过初筛和复筛共获得58个阳性信号。用所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之自动亚克隆为重组质粒,用此亚克隆质粒转化宿主菌JM109并从中提取重组质粒进行PCR、酶切和测序分析。序列分析表明:共获得新cDNA序列21个。将前5个cDNA登录GenBank/ncbi,获取登录号。所获阳性克隆为青海血蜱保护性抗原的筛选奠定了基础。

中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库的建立和分析

目的 :为研究开发眼镜蛇毒药用基因工程产品 ,筛选克隆及表达相关药用功能基因 ,构建中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库 .方法 :一步法提取总RNA ,Oligo(dT)纤维素层析柱纯化mRNA ,逆转录PCR合成双链cDNA ,分级分离除去小片段后 ,收集大于 5 0 0bp的cDNA片段 ,取 1 0ngcDNA与质粒载体pSPORT1连接、转化 .结果 :获得克隆总数为 2× 1 0 5的眼镜蛇毒腺cDNA表达文库 ,重组率 97% .利用PCR技术从该文库扩增了心脏毒素 3(CTX 3)和磷脂酶A2 (PLA2 )基因的cD NA .通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,获得 2 4个中华眼镜蛇毒腺EST序列 .结论 :所建立的毒腺cDNA表达文库质量较高 ,可用于进一步筛选。

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的构建

为了克隆和研究具有免疫原性的长角血蜱基因。应用建库试剂盒成功构建了长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库．在无Rnase污染的环境下摘取半饱血长角血蜱雌蜱唾液腺。并从中提取RNA，进而纯化mRNA。利用oligo（dT）引物反转录合成双链cDNA，并在其两端加EcoRⅠ／HindⅢ定向接头并酶切，过柱分级分离后。将cDNA分子定向连接到具有EcoRⅠ／HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体中．经体外包装转染E．coliERl647宿主菌，进行文库容量测定和扩增．以扩增文库的DNA为模板。利用载体通用引物检测cDNA文库中插入片断的大小和质量．经检测。所构建长角血蜱cDNA文库的基础库容量约为4．2×10^6pfu／mL，插入片段主要集中在300～2000bp之间．说明文库质量高、代表性强。

长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的构建及免疫学筛选

目的构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因。方法在无RNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸[oligo(dT)]为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将cDNA分子定向克隆至具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体。用噬菌体包装蛋白对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)ER1647,从而构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库。使用兔抗长角血蜱全蜱血清对该文库进行免疫学筛选,经过2次筛选得到的阳性噬菌体转化E.coli BM25.8亚克隆为重组质粒,转化E.coli JM109,提取重组质粒进行PCR和测序分析。结果长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的基础库容量为1.8×106pfu,重组率为100%,扩增后的滴度为2.4×109pfu/ml。筛选获得42个阳性克隆,序列分析表明有12个新cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱原肌凝蛋白、环状扇头蜱幼蜱未知蛋白、黑腹果蝇染色体2R、褐黄血蜱线粒体DNA、青海血蜱HqL09、Hq05和肌球蛋白轻链mRNA等具有同源性。结论构建了长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,获得的阳性克隆为长角血蜱功能性抗原的研究奠定基础。