扩增片段长度多态性分析及其在微生物学中的应用

目前建立了多种对原核和真核生物鉴定分型的DNA分析技术 ,其中最新的、最有前途的DNA技术之一为扩增片段多态性 (AFLP)分析 ,AFLP分析把广泛的适用性与高分辨力和高重复性有机地相结合 ,已在动植物遗传学、医学诊断、微生物分型和种系发育研究中广泛应用。本文介绍AFLP分析原理。

限制性片段长度多态性聚合酶链反应法检测人细胞色素氧化酶2D6药物代谢相关基因位点多态性

目的建立测定人细胞色素氧化酶2D6(CYP2D6)基因多态性的限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR RFLP)检测方法。方法通过增加PCR扩增体系中DNA模板上样体积、降低引物浓度以及减少限制性内切酶的用量等方法改进、优化实验条件,建立以PCR RFLP法为基础的肝药酶CYP2D6基因型检测方法。结果采用PCR RFLP法能够检测CYP2D6?2、CYP2D6?10和CYP2D6?14基因型,且过程简便,经济实用。结论该方法检测CYP2D6药物代谢相关基因位点基因型具有简便、高效、准确和经济的特点,可在临床及实验室推广使用。

藻类rDNA特异性片段长度多态性在溺死鉴定中的应用

目的通过检验水体和人体器官中硅藻核糖体DNA(rDNA) 5.8S部分序列、第二内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)序列(5.8S+ITS2)的长度多态性差异,判断溺水死亡案件中受害人的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水。方法以南京市公安局法医中心受理的2例硅藻检验鉴定案例为对象,利用5.8S+ITS2分子标记的长度多态性,分析藻类生物在水体、人体组织中种群结构的差异。结果案例1中,在受害人肺、肝组织和水体样本中均检出种类相近的硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织和水体样本中均检出330 bp和376 bp两种DNA片段,确定受害人系生前溺水。案例2中,在死者肺、肝组织中均未检出硅藻,利用5.8S+ITS2分子标记在死者肺组织中仅获得1条DNA片段,长度为331 bp,相对荧光单位值非常低,确定受害人系死后抛尸入水。结论本方法检验两案例的实验结果符合实际案情和硅藻镜检的结论,利用5.8S+ITS2分子标记研究水体和人体组织中特定微生物的种群结构差异,从而判断溺水死亡的落水地点以及受害人系生前落水还是死后被抛尸入水等问题具有可行性。

结核分枝杆菌北京基因型菌株大片段的多态性研究

目的揭示结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）北京基因型菌株的进化路径，在进化过程中产生的各个进化分支，以及每个分支的北京基因型菌株在人群中的流行情况。方法收集2014年1月至2016年4月天津地区临床分离的567株MTB菌株，首先采用多重PCR试验分析菌株基因组中差异片段207（RD207）的缺失情况，以鉴定收集的菌株是否为北京基因型；然后分析所有的北京基因型MTB菌株基因组中差异区域RD105、RD181、RD150和RD142的缺失情况，以及菌株基因组NTF（noise transfer function）区中插入序列6110（IS6110）的存在情况。结果567株临床分离的MTB菌株中，517株（91．2％）为北京基因型菌株。所有北京基因型菌株中，447株（86．5％）为NTF区含有IS6110的北京基因型现代株；70株（13．5％）为NTF区不含IS6110的北京基因型古代株。基于大片段的多态性分析，北京基因型菌株被分为5个亚型，其中RD181（＋）的北京基因型菌株为22株（4．3％），且全部为北京基因型古代株。RD181（-）／RD150（＋）和RD181（-）／RD150（-）的北京基因型古代株分别为41株（7．9％）和7株（1．4％）。447株现代菌株中，RD181（-）／RD150（＋）和RD181（-）／RD150（-）的分别为404株（78．1％）和43株（8．3％）。结论MTB北京基因型中的现代株是天津地区的主要流行株；北京基因型MTB在人群传播流行中已经进化出5个分支，其中RD181（-）／RD150（＋）的北京基因型现代株为主要的流行分支。

cDNA-AFLP技术在植物表达分析上的应用

阐述了一种mRNA指纹图谱技术 ,即cDNA_AFLP技术的原理和程序 ;该技术具有重现性高、准确可靠、效率高等特点 ,可广泛应用于植物遗传标记分析、基因表达特性研究以及分离植物基因等 ,具有良好的发展前景。

细胞色素P450酶1A2和2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联分析

目的探讨细胞色素P450酶(cytochromeP450enzymes,CYP)1A2、2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术及限制性片段长度多态性(RFLP)测定79例难治性抑郁症患者及107名正常对照者CYP1A2C163A、CYP2C19G681A基因多态性。结果两组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=3.605,P>0.05;χ2=3.154,P>0.05)。难治性抑郁症患者对照组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.853,P>0.05;χ2=0.568,P>0.05)。79名患者中46名接受氟西汀合并小剂量利培酮(0.5～2.0mg/d)治疗,将其分为治疗有效组和无效组,两组间CYP1A2C163A(χ2=0.785,P>0.05;χ2=7.142,P>0.05)CYP2C19G681A(χ2=3.008,P>0.05;χ2=2.722,P>0.05)基因型及等位基因分布差异均无显著性。根据CYP2C19G681A基因多态性将患者分为无突变组(G/G型)和突变组(G/A型和A/A型),两组患者CYP1A2C163A基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.252,P>0.05;χ2=0.682,P>0.05)。结论CYP1A2C163A和CYP2C19G681A基因多态性与难治性抑郁症无显著关联,不是影响利培酮对氟西汀增效作用的主要因素。

铜陵地区脑卒中病人MTHFR C677T基因多态性分布及同型半胱氨酸水平分析

目的探讨铜陵地区脑卒中病人5,10 亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)C677T基因多态性分布的特点及同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)的水平。方法选取2017年6月到2019年4月铜陵市人民医院的脑卒中病人234例、非脑卒中对照者69例,用焦磷酸测序技术检测MTHFR基因C667T多态性,循环酶法检测血清Hcy水平,比较不同组别MTHFR基因型分布特点,并分析不同基因型Hcy水平的差异。结果脑卒中组基因型分布为CC型73例(31.2%),CT型114例(48.7%),TT型47例(20.1%),基因型分布无性别差异;脑卒中组等位基因T频率(44.4%)高于对照组等位基因T频率(33.3%),差异有统计学意义(P<0.05);脑卒中组CC、CT、TT基因型Hcy水平分别为9.20(7.50,12.35)μmol/L、9.60(7.60,12.85)μmol/L、16.00(10.45,30.05)μmol/L,其中TT基因型病人的Hcy水平高于同组CT、CC基因型病人的Hcy水平,差异有统计学意义(P<0.05);脑卒中组TT基因型病人的Hcy水平高于对照组同种基因型的Hcy水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论铜陵地区脑卒中病人MTHFR C677T基因突变频率较高并与Hcy水平相关,可能是脑卒中的危险因素。

2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒基因组非结构4区全长序列的扩增、克隆及分析

目的 获得 2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒 (HCV)基因组全长非结构 (NS) 4区克隆并作序列分析。方法 用限制性片段长度多态性分析 (RFLP)基因分型方法筛选出 2a/Ⅲ型HCV一株。为了获得该毒株全长NS4区基因序列 ,依据代表株序列的NS3区之 3′末端及NS5区之 5′末端相对保守区域合成引物 ,以RT -nested -PCR方法扩增一段 1.3kb的片段cDNA ;将此片段插入pUC19质粒载体。结果 克隆了丙型肝炎基因组非结构NS4区全长基因 ,构建了pUC -NS4重组体 ,对重组体进行酶切鉴定 ,克隆的cDNA与预计的片段大小相符 ,并作序列测定。结论 获得全长NS4区基因克隆 ,经序列分析表明 ,与日本HC -J6有较高的同源性 (92 .1%)。

25个湖北钉螺种群扩增片段长度多态性分子标记的遗传变异研究

目的探讨湖北钉螺种群间的遗传变异及其程度。方法采用扩增片段长度多态性分子标记技术对来自中国大陆10省的25个种群钉螺基因组DNA样品池进行扩增,分析钉螺各种群间的遗传变异并对钉螺种群进行聚类分析。结果25个钉螺种群间的相似系数GSDICE在0．694-0．831之间,Nei无偏遗传一致性在0．635-0．799之间,遗传距离D在0．169-0．306之间,Nei无偏遗传距离在0．225-0．452之间,光壳钉螺种群间的遗传变异程度明显高于肋壳钉螺种群间的遗传变异程度(P<0．01)。25个钉螺种群被聚成3类,A类包括来自福建福清和广西宜州的光壳钉螺种群;B类包括来自四川西昌、普格、丹棱、蒲江、广汉和云南大理的光壳钉螺种群;C类则由其他来自长江中下游地区的17个钉螺种群组成。结论在中国分布的湖北钉螺已发生较大的遗传变异,基因组水平上的钉螺种群聚类结果和其地理分布基本一致。

用cDNA-AFLP技术筛选新生牛软骨无血管区的高表达基因

软骨一直被认为是内源性血管生成抑制物的重要来源.为更好理解软骨血管生成抑制的遗传学基础,对软骨中与血管生成抑制有关的基因进行了初步的探索.本研究应用cDNA-AFLP技术对新生牛关节骨骺软骨无血管区和有血管区的差异表达基因进行分析,筛选无血管区特异表达或高表达的基因,共得到43个无血管区高表达的片段.通过对片段进行亚克隆、测序及同源性分析,结果发现,16个片段与已知基因同源,25个片段只在牛的基因组数据库中找到同源序列,另有2个片段未找到同源序列.在同源基因中,肌钙蛋白Ⅰ亚型其血管生成抑制作用已有较详细报道;S100A7与血管生成和肿瘤发生的关系也已有阐述.另外14个同源基因按生物过程分析,发现参与了细胞周期调节、信号传递、细胞间相互作用及新陈代谢等多个生物过程.研究结果提示,牛软骨组织无血管区的无血管状态可能由多基因介导,其中一些可能是已知或未知的新基因.

2型糖尿病8-异前列腺素F_2α与脂联素基因SNP+45(T/G)多态性的相关性

目的:探讨脂联素基因SNP+45(T/G)多态性与2型糖尿病(T2DM)氧化应激指标8-异前列腺素F2α之间的关系。方法:聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法检测120例T2DM患者(T2DM组)脂联素SNP+45(T/G)多态性,同时选取正常体检者60例为对照组,采用竞争酶免疫测定的方法检测T2DM患者血清8-异前列腺素F2α水平,检测各组空腹血糖、血脂及空腹胰岛素水平,计算HOMA-IR等指标。结果:T2DM患者血清8-异前列腺素F2α水平高于对照组,T2DM患者脂联素SNP+45位点GG基因型频率高于对照组(P<0.05)。T2DM组内GG型的体质量指数(BMI)高于TT及TG型(P<0.05);TT、TG及GG基因型血清8-异前列腺素F2α水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:脂联素SNP+45(T/G)多态性与T2DM氧化应激之间可能无相关关系。

肝脂肪酶基因-514C/T多态性与陕西地区非酒精性脂肪肝人群关系研究

目的:比较陕西地区人群中非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者与正常人群肝脂肪酶(HLG)-514C/T多态性分布差异,探讨其与NAFLD发病易感性关系。方法:选取NAFLD患者96例及正常对照组98例,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因多态位点检测HLG-514位点基因型,并测量其体重指数、腰臀比、血压、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、空腹血糖指数。结果:正常对照组HLG-514CC、CT、TT基因型分别是26.5%、59.2%、14.2%,NAFLD组31.3%、63.5%、5.2%,两组CC基因型频率和C等位基因频率比较有统计学差异。结论:肝脂肪酶-514C/T以杂合子C/T基因型所占的百分比高,其基因多态性与陕西NAFLD患者发病有关。

应用mAPLP方法对湖南地区苗族人群进行mtDNA多态性研究

目的应用多重扩增产物片段长度多态性分析方法(multiplex-amplified product-length polymorphism,mAPLP)建立线粒体DNA编码区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)快速、准确、有效的分型方法。方法根据线粒体DNA SNP位点(11969A、10398A、10400T、12811C、4580A、14979C)设计两条不同的正向或反向引物(使PCR扩增片段长度不同)和一条共用的反向或正向引物,运用多重PCR方法扩增,扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果SNP基因座为片段大小不同的单一谱带,在湖南地区40名无血缘关系苗族个体中,6个SNP基因座的分布频率分别为0.025/0.975、0.200/0.800、0.200/0.800、0.250/0.750、1.000/0.000、1.000/0.000、0.025/0.975。共检出7种单体型,单体型分布频率为0.025、0.050、0.125、0.175、0.025、0.050、0.550。结论此方法是一种简单、快速、准确、有效的SNP分型方法,对建立mtDNA编码区SNP数据库,研究人类群体遗传学,进行法医学个体识别等具有很大的应用价值。

rs3804100、rs3804099及rs2295080基因多态性与黑龙江省2型糖尿病患者并发肺结核关系的研究

目的探究Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)rs3804100、rs3804099位点和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)rs2295080位点基因多态性与2型糖尿病并发肺结核的关系。方法选择2017年1-9月黑龙江省传染病防治院收治的300例2型糖尿病并发肺结核患者作为观察组,以及同时期在哈尔滨医科大学附属第四医院内分泌科就诊的300例2型糖尿病患者作为对照组。所有患者收集血液提取DNA,用PCR技术对TLR2的rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点进行基因多态性检测,并对这3个基因位点多态性与2型糖尿病并发肺结核的关系进行单因素和logistic多因素分析。结果单因素分析结果显示,TLR2的rs3804100位点TT、TC、CC(T:胸腺嘧啶;C:胞嘧啶)基因型在观察组和对照组分布构成比分别为51.3%(154/300)、25.7%(77/300)、23.0%(69/300)和47.0%(141/300)、31.3%(94/300)、21.7%(65/300),差异无统计学意义(χ^2=2.382,P=0.304);TLR2的rs3804099位点TT、TC、CC基因型在观察组和对照组分布构成比分别为53.0%(159/300)、29.7%(89/300)、17.3%(52/300)和54.3%(163/300)、33.0%(99/300)、12.7%(38/300),差异无统计学意义(χ^2=2.759,P=0.252);mTOR的rs2295080位点TT、TG、GG(G:鸟嘌呤)基因型在观察组和对照组分布构成比分别为26.7%(80/300)、67.3%(202/300)、6.0%(18/300)和24.3%(73/300)、66.0%(198/300)、9.7%(29/300),差异无统计学意义(χ^2=2.935,P=0.231)。logistic多因素分析结果显示,TLR2的rs3804100位点TC、CC基因型的OR(95%CI)值分别为1.261(0.591~2.689)和1.284(0.542~3.042),P值分别为0.549和0.569;TLR2的rs3804099位点TC、CC基因型的OR(95%CI)值分别为0.752(0.461~1.227)和0.729(0.430~1.235),P值分别为0.254和0.240;mTOR的rs2295080位点TG、GG基因型的OR(95%CI)值分别为1.789(0.890~3.596)和1.603(0.839~3.063),P值分别为0.103和0.153。结论 TLR2基因rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点多态性与黑龙江省2型糖尿病并发肺结核均无相关性。

细胞因子基因多态性与肺结核并发糖尿病易感性的相关性研究

目的探索细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）＋874A／T位点、白细胞介素（IL）-10-1082G／A位点和-592A／C位点基因多态性与肺结核并发糖尿病（pulmonary tuberculosisanddiabetic mellitus，PTB-DM）易感性的关系，以及遗传危险因素在PTB-DM发病机制中的作用，为PTB-DM高危人群基因多态性筛查提供理论依据。方法采用病例对照研究方法，纳入江苏省2013年4月1日至2014年3月31日3个市（县）142例PTB-DM患者（PTB-DM组），同期选取诊断为结核病的患者147例（TB组）和糖尿病患者141例（DM组）作为对照。通过结构式问卷调查获取研究对象社会人口学信息，采集患者血样并提取DNA，采用聚合酶链式反应并限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length plymorphism，PCR-RFIF）方法检测IFIFN＋874A／T位点、IL-10-1082G／A位点和-592A／C位点基因多态性。采用EpEPiData和SPSS16．O统计软件录入与分析数据，运用单因素方差分析和多因素logistic回归分析I附7＋874A／T位点、IL-10-1082G／A位点和-592A／C位点基因多态性与PT昏DM易感性的相关性。结果IFN-γ十874A／T、IL-10一592A／C、IL-10-1082G／A位点经PCR扩增和基因多态性位点分型鉴定，分别获得等位基因A和T、A和C、G和A，以及基因型AA、AT、TT；AA、AC、CC；GA、AA。基因多态性检测结果显示，仅PT昏DM组IL-10-1082G／A位点A等位基因频率（92．61％，263／284）高于DM组（87．59％，247／282）（χ^2=3．995，P=O．046）、AA基因型频率（85．21％，121／142）高于DM组（75．18％，106／141）[校正OR（αOR）-1．970；95％CI：1．066-3．643；P=0．030]。IL-10-592和-1082两位点间存在连锁不平衡（D=0．959，-0．181，P〈O．001），PTB-DM患者的IL-10 C-A单倍型频率（25．90％）明显高于DM组患者（17．60％）（OR=1．590，95％CI=1．056-2．396，P=0．026）。结论IL-10-1082位点的从基因型可能与PT昏DM易感性有关，为疾病共患的危险因素；IL-10单倍型与PTBDM易感性存在相关性，其C-A单倍型可能使DM患者共患TB的风险上升。而IL-10-592A／c位点和IFN-γ＋874A／T位点可能与DM患者对TB的易感性、或者TB患者对DM的易感性无关。

利用AFLP方法研究嗜肺巴斯德杆菌的遗传多态性

目的 针对嗜肺巴斯德杆菌分类变更及其在实验动物中感染率高的问题,建立该菌的快速基因分型方法,为其检测方法的修订及有效控制提供支撑。方法 利用扩增片段长度多态性方法(AFLP),对实验动物中分离的314株嗜肺巴斯德杆菌及2株标准菌株进行遗传多态性及分子流行病学分析。结果 AFLP方法将受试分离株共分为了11个基因簇、190个基因型,多态性条带主要有31~36条,辛普森多样性指数0.992。基因簇AC7为北京地区的主要流行群。结论 本研究表明北京地区实验动物中的嗜肺巴斯德杆菌基因型丰富,2株标准菌株所在的基因簇在多态性上有明显区别。某些不同来源动物存在交叉污染、污染源多,以及长期污染的情况。

安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源AFLP分析

为探讨安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源遗传多样性和鉴定砀山酥梨营养系变异,以该保护区内27个梨资源代表类型为试材,利用AFLP分子标记技术开展研究。运用从36对选择性扩增引物中筛选的3对引物组合进行扩增,每对引物可扩增出50条以上的清晰条带,扩增片段长度为30～600bp,9个引物组合共扩增出清晰可靠的DNA谱带540条。其中498条为多态性条带,平均多态性比率为92.2%。聚类分析表明,当遗传距离阈值为39.2～40.1时,全部供试生物型可分为6类:第1类为砀山酥梨及其变异类型和原产砀山的地方品种、杂交种;第2类包括雪花梨、鸭梨、紫酥、慈梨、早美酥、丰水、新高,白梨和砂梨聚在了一类;第3类包括库尔勒香梨、红香酥;南果梨、红巴梨、杜梨各为一类。与砀山酥梨相比,砀山酥梨的8个营养系变异类型均扩增出了特异带,特异条带出现的数量为5～15条不等。说明安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源遗传多样性丰富;砀山酥梨8个营养系变异类型均在DNA水平发生了不同程度的突变。

辣椒细胞质雄性不育基因的AFLP分析

本文采用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术对辣椒(Capsicum annuum L.)细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+MseⅠ-NNN组合,有60对引物组合均在两系间扩增出5447条带,多态性位点为4个,其中在不育系材料中仅有2个多态性片段AGC/CGC378和ATC/GAG446,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为340bp和408bp,它们编码的氨基酸序列与烟草基因组线粒体DNA序列同源性达94%和96%。

钉螺AFLP分子标记电泳图谱信息数量化数据的分析

目的探讨扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记电泳图谱信息数量化数据的分析方法。方法从现场采集的钉螺中筛选出40只阴性钉螺,随机分为两组,用于基因组DNA模板的制备。再用Glyko BandScan软件将钉螺扩增片段长度多态性电泳图谱信息数量化,使用不同的读带标准读带,得到相应的数据集,然后对这些数据集进行遗传学统计分析与描述性总结。结果不同的标准所得到的遗传变异结果均有所差别,但随着读带标准值的增加,反映钉螺种群遗传多样性指标(如:Shannons′信息指数)也增加,当其增加到一定水平时,又开始下降,而基因流和基因一致度则相反。不同读带标准所得的遗传变异结果均呈明显的正态分布(P>0.05)。以总灰度或以总灰度百分比划分读带标准,所得遗传变异结果的平均值均十分接近。两组钉螺平均基因一致度在总灰度百分比数据中为0.956,在总灰度数据中为0.958;两组间的平均遗传距离在总灰度百分比数据中为0.045,在总灰度数据中为0.043。结论将电泳图谱信息数量化,再以不同的读带标准去处理与分析数据的模式,是一种较为合理且准确的分析方法。

帘蛤科4种养殖蛤群体遗传多样性和种间关系的fAFLP分析

利用荧光标记扩增片段长度多态性（fAFLP）技术对文蛤（Meretrix meretrix）、青蛤（Cyclina sinensis）、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）和硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）4种帘蛤科贝类的群体遗传多样性和种间关系进行了研究。选择EcoRⅠ／MseⅠ进行酶切，使用6个E＋3／M＋3引物组合进行扩增，共获得1096个位点，多态位点比率95．1％，片段长度50-456bp。其中，文蛤、青蛤、菲律宾蛤仔和硬壳蛤分别得到681，715，702和694个位点，相应的多态位点比率为76．8％，81．7％，83．0％和75．1％，得到17个种特异性位点，可作为4物种特征标记。分析了群体遗传相似系数和遗传多样性指数以及种间遗传相似系数。结果表明，硬壳蛤群体遗传相似系数最高（0．6709），遗传多样性指数最低（0．2360）；菲律宾蛤仔群体遗传相似系数最低（0．5925），遗传多样性指数最高（0．2618）；根据遗传相似系数采用UPGMA法构建了4物种32个体的聚类图，表明文蛤与菲律宾蛤仔遗传关系最近，青蛤与其他3物种遗传关系较远。