橡胶树冷应答转录组cDNA-AFLP分析

以橡胶树11个抗寒无性系和12个不抗寒无性系为研究对象,利用cDNA-AFLP技术对23个橡胶树无性系低温处理前后的基因表达谱进行差异分析。结果表明:通过100对引物组合的扩增筛选,共获得12条在2组材料中表现一致的差异片段(GenBank登录号:GO269543-GO269554);BLASTn和BLASTx比对分析显示,TDF7-8,TDF5-15,TDF16-103条片段分别与植物抗逆相关的ABC转运蛋白、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)、WRKY基因有较高相似性,其余9条片段在GenBank未比对到同源序列。

利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系的表达差异

利用cDNA AFLP技术 ,对白菜核雄性不育两用系可育株群和不育株群分析显示 :花蕾之间基因表达存在差异 ;莲座期叶片之间、开花期叶片之间和花茎之间基因表达无差异 ;叶片、花茎和花蕾之间基因表达存在差异。对开花期的小蕾、中蕾和大蕾分析显示 :10对引物中 ,1对在可育株中蕾和大蕾中扩增出 1条特异带 ,另 1对扩增出 1条在可育株中蕾中表达丰度高于不育株中蕾的条带 ,其余 8对未发现差异条带。对上述表达丰度有差异的基因进行Northern验证 ,结果与之一致 ,表明cDNA AFLP技术可以用于植物雄性不育基因表达差异的研究。

利用cDNA-AFLP技术分析小麦成株抗条锈性差异基因表达特征

采用cDNA-AFLP技术,对成株抗条锈小麦品种兴资9104在成株期受条锈菌生理小种CY32侵染后5d内9个时间点的基因表达谱进行了分析。共筛选64对引物,产生32320个转录本(TDF);用37对引物检测到2201个(6.81%)差异TDF,其中926个TDF诱导表达,1275个下调表达。经大规模克隆、测序分析,最终获得330个差异TDF,聚类分析得到259个EST(unigenes),命名为aTaPST1至aTaPST259(GenBank登录号为FL645754～FL646011和FL646262)。经Blastx比对和功能分类分析,其中96条EST(37.07%)未找到同源性匹配,68条(26.25%)与未知功能蛋白同源性较高;其余95条ESTs主要涉及能量(11.20%)、基础代谢(4.63%)、转录调控(3.86%)、抗病与防御(3.86%)、蛋白质运输和储存(3.09%)、蛋白质合成和细胞生长(各2.32%)以及信号转导(1.54%)等。选取抗病与防御、转录调控及信号转导类等相关的6个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。小麦成株抗条锈性分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病与防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。

利用cDNA-AFLP技术获得小麦耐盐性相关基因TaVHA-C

【目的】利用cDNA-AFLP技术对耐盐性受主效基因控制的小麦品系98-160盐胁迫前后基因表达的变化进行分析。【方法】对112个克隆的cDNA差异表达片段进行了Blast-x分析。【结果】约有65.2%的片段与已知基因有较高的同源性,从中筛选出18个与小麦耐盐性密切相关的片段,主要包括转录因子、与离子转运有关的蛋白、信号传导相关蛋白、胁迫相关蛋白以及与蛋白-蛋白相互作用有关的蛋白。以94号片段为基础,通过电子延伸和RT-PCR,克隆了小麦液泡膜ATPaseC亚基(TaVHA-C)的全长cDNA,Northern结果表明,在胁迫的早期(0～2h)TaVHA-C基因的表达基本不变,随着胁迫时间的延长(6～12h),TaVHA-C基因的表达逐渐减弱,以后(24～72h)又逐渐增强。低温对TaVHA-C基因的表达有明显的抑制作用。【结论】利用cDNA-AFLP技术分离差异表达片段进行相关基因的研究是可行的。

白桦雄花突变体早期发育差异表达基因的cDNA-AFLP分析

白桦是雌雄同株的单性花树种,已发现的天然的雄花序突变体,其结构和生殖发育均不同于正常雄花序,显示出明显的雄性不育特征。为揭示该雄花突变体的发育机制,采用cDNA-AFLP分子标记技术,分析白桦雄花突变体发育早期的差异基因表达谱,共获得81个ESTs,51个ESTs与GenBank中的基因相似性较低,视为新基因,30个ESTs与已知蛋白具有较高同源性。GO和KEGG对其功能的注释表明,这些蛋白参与催化活性、结合活性、生物调节信号转导、生物合成以及基因编码转录因子和花发育等过程。选择5个与白桦花发育有关的ESTs,分别为MAP激酶、泛素结合酶、纤维素合成酶、热激蛋白和细胞色素P450,应用Real-time RT-PCR检测它们在白桦雄花突变植株的不同组织和雄花发育过程的转录表达,结果表明,这些基因在白桦突变植株中表达水平发生不同程度的上调或下调表达,推测它们参与白桦营养生长和生殖发育,并与雄花的迟缓发育、花药和花粉发育异常等雄性不育特征有关。

糜子抗旱及复水相关基因的cDNA-AFLP差异显示

以糜子抗旱种质为实验材料,采用cDNA-AFLP技术分析四叶期糜子幼苗叶片在干旱、复水与对照等条件下的基因表达差异。选取了36个引物组合(6个荧光标记TaqⅠ引物×6个非荧光标记MseⅠ引物)进行选择性扩增,结果表明,这些引物组合都有很好的扩增效果,在三种处理之间均能扩增出表达模式不同的差异片段。随机选取了8个干旱特有和4个复水特有的差异片段进行了克隆测序。利用NCBI的Blastn进行序列的dbEST比对结果表明,12个EST序列中有2个分别与小麦、玉米的EST序列有较高的相似性,其余10个与已知EST序列的同源性都很低,可能为新的糜子抗旱相关基因。用Blastx与Genebank的非冗余蛋白数据库进行比较结果表明,其中的一个序列(DR007245)与N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸五肽(UDP-N-acetylglucosamine--N-acetylmuramyl-(Pentapeptide))的同源性较高,两个序列(DR007249,DR007250)与水稻的反转录转座子蛋白具有较高的同源性,反转录转座蛋白在植物抗旱、耐盐等抗逆境方面有重要作用。另外还有两个序列(DR007251,DR007252)与两种假定蛋白同源性较高。

YS型小麦温敏不育系育性转换基因的cDNA-AFLP分析

对YS型小麦温敏雄性不育系A3017不育与可育条件下不同发育时期的幼穗提取mRNA,进行cDNA- AFLP表达差异分析,64对引物组合获得差异片段1160个。统计分析表明,单核期表达的差异片段数最多,认为这一时期是育性转换的关键时期。对其中12个在不育或可育条件下表达的差异片段进行同收、克隆、测序,经 BLAST序列比对分析表明,可育条件下的4个EST与物质转运和能量代谢过程的铁转运蛋白1和ATP合酶α亚基,基因表达调控的反转录转座子跳跃多聚蛋白和转座子相似序列同源。不育条件下有5个EST与细胞内信号传导的ZCCT转录因子和光敏色素蛋白,基因表达调控的转座酶、染色体浓缩因子和亮氨酸富集蛋白的编码基因同源。结果表明YS型小麦温敏雄性不育系A3017的育性转换与细胞内基因表达调控、物质和能量代谢及信号传导过程有关。

利用cDNA-AFLP技术筛选菊花开花相关基因

【目的】分析不同光周期诱导下菊花茎尖差异表达的基因,筛选菊花开花相关基因。【方法】将菊花品种‘神马’分别进行长日照(16h/8h,昼/夜)和短日照(8h/16h,昼/夜)处理后,利用cDNA-AFLP技术筛选菊花茎尖差异表达的转录衍生片段(Transcript-derived fragment,TDFs),并对其进行验证、克隆、测序和生物信息学分析。【结果】64对引物组合检测到2 917个cDNA片段,获得差异表达的TDF共835个,其中584个为上调表达,251个为下调表达。对克隆测序成功的50个差异表达TDF进行分析,结果表明,36个TDF可以在NCBI数据库中找到同源序列。其中31个TDF为已知功能的基因(dbEST登录号:JG700127-JG700157),5个TDF未找到同源序列。按照其功能分类,将31个差异表达基因分为7类:信号转导、分化发育、转录调控、蛋白质代谢、能量与代谢、抗病与防御等相关基因、未知或假定蛋白基因及未知基因。对选取的6个与开花相关的TDF进行半定量RT-PCR验证,结果表明,6个基因片段在短日照条件下均特异表达或表达上调,而在长日照下均未见表达或表达下调,这与cDNA-AFLP表达谱结果一致。【结论】利用cDNA-AFLP技术筛选了菊花花芽分化期多个与菊花开花相关的基因片段,这些基因片段可进一步用于功能鉴定和转基因利用。

利用cDNA-AFLP检测甘蓝雄性不育相关基因的时序性表达

通过cDNA-AFLP技术分别对4种具有不同败育时期特征的甘蓝雄性不育材料和遗传背景一致的可育材料进行分析,揭示了4种不育类型育性相关基因的时序性表达特征,并对4种育性相关基因分别选取1个转录表达片段(TDFs)克隆测序。结果表明,获得的113条不同表达方式TDFs可分为12种模式:其中按照不同雄性不育败育顺序表达中断的有A、B、C、D4种模式,分别代表造孢细胞期、花粉母细胞期、四分体前期和四分体后期发育中断的育性相关基因。这4种表达模式包括76条TDFs,占总TDFs的67·25%。结合发育中断模型和序列分析结果,推测糖基水解酶家族基因、具有VQ结构域的基因、富含甘氨酸蛋白和促进游离小孢子解离的果胶裂解酶基因可能分别参与上述花药发育4个时期雄性育性的建成。

适于cDNA-AFLP的黄瓜幼叶总RNA快速高效提取方法

为了快速高效地提取黄瓜幼叶总RNA，满足于cDNA-AFLP实验的要求。对Trizol试剂提取总RNA的方法进行了改进，所提RNA经琼脂糖电泳检测，其28S、18S、5S3条带清晰，完整性好，每0．1g幼叶可获得RNA100～150μg，产率高；经反转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测，证实提取的RNA能满足反转录和cDNA-AFLP对RNA质量和数量的要求。

黄瓜cDNA-AFLP分析体系的建立

以黄瓜为研究材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜黄瓜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明,适用于黄瓜dscDNA的酶切组合为TaqI和VspI,dscDNA酶切用量为300 ng,用作预扩增模板的连接产物稀释倍数为1倍,作为选择性扩增模板的预扩增反应产物的适宜稀释倍数为30倍。

应用cDNA-AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因

采用cDNA-AFLP技术筛选获得了5个草菇冷诱导表达基因片段VC1、VC2、VC3、VC4和 VC5。测序结果表明,5个DNA片段大小分别为247bp、219bp、172bp、350bp和171bp。同源性BLAST 搜索结果显示,VC1、VC2、VC3、VC4和VC5片段目前都没有同源的核酸序列;VC1片段翻译的蛋白质序 列与粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的假拟蛋白具有一定的同源性,VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的 AMP脱氨酶具有一定的同源性,VC3片段翻译的蛋白质序列与Daniorerio的糖原合酶激酶3α具有较高的 同源性,VC4片段翻译的蛋白质序列与Leuconostocmesenteroides的假拟蛋白有一定的同源性,VC5片段翻译 的蛋白质序列没有搜索到同源序列。

白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化

【目的】寻找与白菜叶缘裂刻发育相关的表达基因,了解叶缘裂刻调控的分子机理。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究白菜叶全缘和裂刻近等基因系间基因表达的差异。【结果】共获得57条差异片段,合并归属于55条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有25条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有30条。54条差异片段可以在NCBI数据库中找到同源序列(包括EST)、其中42条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用AFLP转化的SCAR标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果一致。【结论】构建了白菜叶缘裂刻发育调控基因表达谱,识别了与已知NAC036、DP-2、MYB77、TCP24参与调控裂刻发生基因密切相关的片段。基于cDNA-AFLP特异序列,开发了1条与裂刻紧密连锁的SCAR标记,命名为SEL7B16-SCAR,可用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。

cDNA-AFLP法筛选红树植物盐应答基因

【目的】分析红树植物盐胁迫下基因表达谱,分离识别耐盐相关基因。【方法】分别对红树植物-秋茄进行海水和淡水处理。分时提取总RNA进行等量混合,获得两种不同处理的样品池。采用cDNA-AFLP技术进行表达差异分析。【结果】256对引物组合共筛选了约15 000个cDNA片段,获得差异片段61个。差异基因表达模式分为2类,即海水处理诱导上升和下调表达,其中上升表达的基因片段为36个,下调表达的基因片段为25个;其中38个可视为已知基因。按照其功能分类可分为8大类:基础代谢、跨膜蛋白、信号转导、蛋白质代谢、转录因子、细胞骨架、抗病蛋白、假想蛋白,而其中又以基础代谢相关基因所占比重最大。【结论】构建了红树植物-秋茄在盐胁迫下的基因表达谱,从基因组水平上识别了一批受盐胁迫诱导或抑制表达、与耐盐相关的基因,这些新基因可用于耐盐的分子机理研究。

利用cDNA-AFLP技术研究苹果柱型与非柱型cDNA的差异表达

以苹果(Malus×domesticaBorkh.)柱型品种舞姿、非柱型品种富士及其杂交F1群体中柱型、非柱型单株为研究试材,应用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术,研究柱型与非柱型苹果cDNA的差异表达,探讨了苹果柱型基因Co表达的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了1630条在柱型与非柱型苹果中差异表达的片段。经过BSA(bulked segregant analysis)分析和反向Northern杂交鉴定,获得了11个差异表达的cDNA片段,并进行了克隆、测序和序列同源性检索分析。有5个片段在GenBank数据库中发现同源序列,其余的6个功能未知。核酸和氨基酸比对分析中同源性最高的是片段A7和A16。A7的核苷酸序列同源于红叶石楠Photinia fraseri26S核糖体RNA(97%)、蛋白同源于玉米的细胞色素P450单加氧酶(91%),A16的核苷酸(85%)及蛋白(93%)同源于直果草属Triphysaria versicolor的α-expansin2基因。对A7、A16两个候选基因片段再进行正向Northern杂交验证,在富士中表达最强,在非柱型后代、柱型后代及舞姿中表达依次减弱。由此推断,由细胞色素P450单加氧酶基因所调控的赤霉素GAS变化影响了苹果柱型性状的表达。

盐爪爪耐盐相关基因的cDNA-AFLP分析

以不同浓度NaCl（0、100、200、300、400和500 mmol/L）处理生长了4周的盐爪爪（Kalidium foliatum）,48h后取其幼嫩叶片用于RNA提取,并进行了cDNA-AFLP表达差异分析.结果表明,用256对引物扩增出连续性差异片段155条,按照NaCl浓度升高的顺序,划分为8种差异带类型,即强→弱＂、弱→强＂、有→无＂、无→有＂、有→无→有＂、无→有→无＂、强→弱→强＂和弱→强→弱＂.测序后获得176个新表达序列标签（ESTs）,已将长度大于100 bp的162个ESTs登录到GenBank,登录号为HO205290~HO205450.经BLAST序列比对分析发现,盐爪爪的耐盐性可能与能量、新陈代谢、防御、转运、转录和翻译等相关蛋白有关.

应用cDNA-AFLP研究甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因

【目的】显性细胞核雄性不育(DGMS)是油菜杂种优势利用的重要途径。为了更好地理解该不育系统的分子机理,对甘蓝型油菜显性核不育的育性相关基因进行初步的研究。【方法】利用cDNA-AFLP对显性核不育材料两用系Rs1046AB的不育株和可育株进行了对比分析。【结果】共得到32个差异片段,分别属于27个uniGene,其中在可育株中增强或特异表达的有26个,不育株中只有1个。17个可以在NCBI数据库中找到同源序列(包括EST),10个没有找到同源序列。对17个已知序列的分析表明,这些片段参与了代谢、转录、细胞周期、蛋白质修饰、细胞间运输、信号转导和花发育等相关过程。此外,Northern印迹分析结果表明检测片段的表达模式与PAGE胶结果一致。【结论】本研究为更深入的研究甘蓝型油菜显性核不育的育性相关基因提供了基础,并对雄配子的发育研究也具有一定参考价值。

小麦抗黄矮病相关基因cDNA-AFLP差异表达片段的验证

cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有利工具,广泛用于植物抗病、抗逆和生长发育等研究领域。本研究以cD-NA-AFLP技术分离的抗黄矮病小麦与感黄矮病小麦间差异表达片段为对象,利用反向Northern方法,从cDNA-AFLP技术筛选的46个候选抗黄矮病防御基因差异表达片段中,筛选出抗黄矮病相关防御基因片段6个;采用对回收的差异片段进行再扩增(延伸引物再扩增),再与原选扩产物一起进行PAGE电泳分析法,并结合半定量RT-PCR分析法,又验证了候选抗黄矮病相关基因表达片段3个。反向Northern方法以及对回收的差异片段进行再扩增(PAGE再分析法),结合(半)定量RT-PCR分析方法,可以比较准确地验证cDNA-AFLP所筛选出的基因差异表达片段。

利用cDNA-AFLP技术鉴定甘蓝显性核不育基因相关表达序列

利用cDNA-AFLP技术,比较分析了一个甘蓝与两个青花菜自交系回交转育的显性核基因雄性不育材料与对应可育亲本植株花蕾发育过程中基因表达的差异。将花蕾混合提取RNA合成cDNA建立6个cDNA池,分析128个引物组合获得了26000个片段,共鉴定24个片段与雄性不育相关,其中13条表现为质的差异,11条表现为量的差异;将其中引物组合A16T15产生的300 bp左右的差异片段进行克隆测序,BLAST结果表明,该序列与花粉特异性相关的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性达89％。

甜瓜化感自毒作用响应基因的cDNA-AFLP分析

本研究以甜瓜种质＂新银辉＂为试验材料,利用浓度为0.03 g.mL 1的新鲜甜瓜植株水浸提液处理甜瓜幼苗,通过cDNA-AFLP技术分析甜瓜化感自毒作用相关基因及其表达情况。试验中利用82对引物进行扩增,共获得3 600多条差异表达转录衍生片段（TDFs）,平均每个引物组合可扩增出30~50条条带,片段大小集中在50~800 bp之间,根据条带强弱和有无的变化,其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表达4种情况。选取其中103条TDFs进行回收、测序,共获得75条有效序列,其中上调表达39条,下调表达21条,瞬时表达15条。BLAST结果分析显示其中55条与已知功能基因具有较高的同源性,选取其中10条TDFs,以甜瓜Actin基因为内参照,对其在不同胁迫处理时间的表达情况进行半定量RT-PCR验证,分析结果与cDNA-AFLP结果基本吻合,表明cDNA-AFLP技术是研究甜瓜化感自毒作用相关基因差异表达的有效方法。55条TDFs的BLAST结果显示,甜瓜自毒作用涉及到的基因表达情况较为复杂,与信号转导、能量代谢、蛋白合成、离子运输、逆境响应和转录调控等过程均有关系,这一结果为探讨甜瓜化感自毒作用的分子机理和相关基因的克隆提供了理论依据。