抗HBsAg×抗CD3 diabody-cIFN原核表达及活性鉴定

目的构建人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)×人源化抗CD3双特异双链抗体(diabody)与重组复合干扰素(consensus Interferon,cIFN)的融合蛋白(抗HBsAg×抗CD3 diabody-cIFN,简称S×3Db-cIFN)的表达载体,在原核表达系统中进行表达,并鉴定表达蛋白的活性。方法对相关的模板重组载体进行限制性内切酶消化和T4连接酶的连接,构建目的重组载体pRA-cIFNSHOL和pRA-OHSL,经测序鉴定后分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用SDS-PAGE和Western blotting进行表达鉴定,用GuHCl阶段透析法重新折叠获得目的蛋白S×3Db-cIFN。用ELISA和流式细胞术进行S×3Db-cIFN的抗HBsAg抗体活性和抗CD3抗体活性。结果成功构建了表达载体pRA-cIFNSHOL和pRA-OHSL,并实现了大肠杆菌中的高效表达和表达后的重新折叠,获得了目的蛋白S×3Db-cIFN,蛋白复性率为24%。用ELISA和流式细胞术初步鉴定融合蛋白的活性,结果显示S×3Db-cIFN具有明显的抗HBsAg抗体活性和抗CD3抗体活性。结论用基因工程方法成功制备了人源(化)抗HBsAg×抗CD3 diabody与cIFN的融合蛋白,此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和抗CD3抗体活性,有可能成为有效的抗HBV免疫导向药物,有待进一步探讨其应用价值。

人源抗HBsAgscFv与重组复合干扰素融合蛋白的高效表达及活性鉴定

目的 :制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)单链抗体 (scFv)与重组复合干扰素 (consensusinterferon ,cIFN)的融合蛋白 ,并鉴定其活性。方法 :把人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白的表达载体pRA cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL2 1之后大量表达抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白。SDS PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白 ,经纯化并变性复性包涵体蛋白后用ELISA、流式细胞仪、MTS非放射性活细胞比色定量法及HBsAg血凝抑制试验等进行融合蛋白的抗HBsAg抗体活性和干扰素活性测定。结果 :SDS PAGE和Westernblotting结果显示 ,抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白在BL2 1大肠杆菌中大量表达 ,表达量超过 10mg L培养基 ;ELISA和流式细胞仪结果显示 ,所表达的目的蛋白具有抗HBsAg和IFNα的免疫活性 ,且特异性良好 ;MTS和HBsAg血凝抑制试验结果显示 ,融合蛋白具有明显的PLC PRF 5细胞增殖抑制活性和HBsAg分泌抑制活性 ,表明所获得的抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白具有抗HBV病毒活性和HBV感染细胞增殖抑制活性。结论 :用基因工程方法成功制备了人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白 ,此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和IFNα活性 。

干扰素γ在鸡体内的消长规律

以不同剂量的重组cIFNγ对SPF鸡进行免疫注射,用ELISA法检测cIFNγ在体内的消长。研究结果表明:注射给药后2 h即可在多个器官中检测到cIFNγ;8～24 h,cIFNγ在体内的分布达到高峰;2～4 d后,cIFNγ在体内的分布显著下降;cIFNγ的注射剂量与血药浓度并不呈线性相关,但高剂量的cIFNγ具有显著诱导体内自身cIFNγ表达的能力,尤其是诱导脾脏和淋巴器官中cIFNγ的表达;在高剂量cIFNγ的作用下,鸡体内cIFNγ可维持30 d以上。在接种新城疫疫苗后的2～8 d,也可在鸡的各个组织和器官中检测到cIFNγ低剂量的表达。

加强对丙型病毒性肝炎治疗的研究

在病毒性肝炎中,丙型病毒性肝炎对人类的危害性仅次于乙型病毒性肝炎。全球受丙型病毒(ＨＣＶ)感染者超过1亿,每年受ＨＣＶ新感染者在100万人以上,其中半数以上发展为慢性肝炎,经过10～20年或更久的病程,可能有20%左右的患者发展为肝硬化,1%～5%发展为原发性肝癌。我国人?..

复合α干扰素治疗慢性丙型肝炎疗效与病毒负荷及合并TTV感染关系的随机对照研究

目的 评价复合α干扰素(CIFN)治疗慢性丙型肝炎的效果,以及重叠TTV感染对治疗的影响。方法 选择29例慢性丙型肝炎患者随机分成3组,A组(8例)给予CIFN15μg,B组(10例)给予CIFN9μg,C组(11例,对照组)给予IFNα2a,3MU,均为3次/周×24周,治疗结束后随访24周,于治疗结束时和随访结束时评价ALT及HCVRNA应答。采用套式聚合酶链反应方法对合并TTV感染情况进行回顾性研究。结果 A、B两组治疗结束时及停药24周时的ALT复常率、血清HCVRNA阴转率均较对照组高,因样本量少均未达到统计学意义水平。综合比较CIFN和IFNα2a的疗效,则前者随访结束时的持久应答率显著高于后者。2种剂量CIFN组间应答反应无明显区别。治疗前血清病毒含量与干扰素应答有关,CIFN对于高病毒负荷组患者的疗效优于IFNα2a组。合并TTV感染者(8/22,36.4%),重叠感染患者与非重叠感染者对干扰素应答反应无显著差别,8例TTV感染者CIFN治疗后6例血清TTVDNA阴转。结论 CIFN治疗慢性丙型肝炎远期疗效及高病毒负荷患者的疗效较好;重叠TTV感染对慢性丙型肝炎干扰素疗效无明显影响。TTV似对CIFN较敏感。

pH对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素的降解影响

使用Pichiapastoris表达重组人复合0c干扰素（cIFN）会发生降解、聚合等不均一表达的现象。在5L发酵罐中考察了不同诱导pH对cIFN表达产生降解的影响，结果发现在适合酵母生长的pH3．0-7．0范围内，当诱导pH为4．0~5．0时，cIFN不均一表达现象最少，生物活性达到2．5×1O^8IU／mL。通过测定发酵液中总蛋白酶活和细胞活性寻找了cIFN降解出现的原因：发现低诱导pH下细胞死亡率升高释放更多酶系，高诱导pH下蛋白酶活性明显增大，两者都使蛋白酶作用加强，加剧cIFN的降解；特别是诱导pH为7．0时，适宜的pH使蛋白酶酶活陡升，将cIFN完全降解。

二硫键对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素的降解与聚合影响

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人复合α干扰素(cIFN)时会形成cIFN分子内二硫键异构体,cIFN发生强烈的降解、聚合等不均一表达现象。体外试验证实了cIFN的3种二硫键异构体,研究了形成不同二硫键异构体的条件和各自的稳定性,包括降解与聚合。当cIFN分子内部二硫键破裂时会对其稳定性造成致命影响,从而使cIFN更容易遭到发酵液中蛋白酶降解和聚合。

鸡IFN-γ基因重组蛋白复性条件的优化及生物活性鉴定

为提高鸡IFN-γ基因重组蛋白的复性效率,用18种不同的复性缓冲液对在大肠埃希菌中表达的cIFN-γ进行复性处理,通过SDS-PAGE分析、考马斯亮蓝定量、对鸡胚成纤维细胞以及对鸡胚的保护试验检测复性产物的得率和生物学活性。结果表明,去污剂和疏水剂能保证蛋白的复性得率和复性效率,重组表达产物得率可高达94.7%;氧化还原电势是cIFN-γ成功复性的关键,有生物学活性的复性产物的复性液中均存在氧化还原对GSSG/GSH;经去污剂处理后再复性的产物对细胞保护的有效浓度显著低于直接复性的蛋白。

复合干扰素联合病毒唑治疗慢性丙型肝炎疗效观察

目的 通过干复津单用或与病毒唑联用对慢性丙型肝炎疗效和安全性的观察 ,探讨慢性丙肝治疗方案。方法 3 0例慢性丙肝患者分成两组 ,对照组 15例 ,单用干复津 9微克肌肉注射 ,每周 3次 ,连续用药 2 4周。治疗组 15例 ,用干复津的同时联用病毒唑 90 0mg/d ,连续使用 2 4周 ,干复津用法同对照组。本研究以治疗结束时和随访时丙氨酸转氨酶 (ALT)复常和丙型肝炎病毒核酸 (HCV RNA)转阴考核药物近期和远期疗效 ,同时观察不良反应。结果 近期疗效 :治疗结束 (2 4W)时实验组和对照组ALT复常率分别为10 0 %和 86 7%,HCV RNA转阴率为 10 0 %和 80 %。远期疗效 :随访 (4 8W)时治疗组和对照组ALT复常率分别为 83 3 %和 77 8%,HCV RNA转阴率为 40 %和 89 9%。结论 干复津单用或与病毒唑联用对慢性丙型肝炎疗效和安全性相似。

Tween-80对Pichia pastoris表达重组人复合α干扰素聚合的影响研究

在5 L发酵罐使用Pichia pastoris表达重组人复合α干扰素(cIFN),考察了Tween-80添加量(以质量体积比计)及添加时间对单体cIFN表达量、生物活性及菌体生长的影响。结果表明,诱导相温度为25℃时,添加0.01%Tween-80能明显抑制cIFN发生聚合,单体含量从41.2%显著提高到82.3%;添加0.04%Tween-80后,生物活性从1.91×108IU.mL-1提高到3.73×108IU.mL-1;在诱导开始后不同时间加入0.02%Tween-80,一段时间后cIFN单体表达量均明显提高。且Tween-80的添加并不影响总蛋白表达和菌体生长。

重组复合干扰素治疗慢性丙型肝炎的临床研究

目的 比较两种剂量的重组复合干扰素 (ConsensusInterferon ,CIFN)和重组干扰素α 2a(IFNα 2a)治疗慢性丙型肝炎患者的疗效和安全性。方法 187例初治的慢性丙型肝炎 (丙肝 )患者 ,随机分成三组 ,分别接受 :CIFN 15 μg(A组 ) 6 1例、9μg(B组 ) 6 5例和IFNα 2a 3MU(C组 ) 6 1例 ,1周 3次 ,共 2 4周 ,在完成治疗后继续随访 2 4周。本试验以治疗结束时和随访时丙氨酸转氨酶(ALT)复常和丙型肝炎病毒核糖核酸 (HCVRNA)逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检查阴转考核药物近期和远期疗效 ,同时观察不良反应。结果 180例完成 2 4周治疗 ,分别为CIFN 15 μg组 5 6例 ,9μg组 6 3例和IFNα 2a组 6 1例。经 2 4周治疗后 ,A、B、C三组的ALT复常率分别为 76 .9%、6 8.3%和 5 7.4% ,HCVRNA的阴转率分别为 89.6 %、73.6 %和 6 0 .4% ,A组和C组比较差异均有显著性 (P<0 .0 5和P <0 .0 1)。在 48周时 ,A、B、C三组的ALT复常率分别为 78.8%、6 3.9%和 5 5 .0 % ,HCVRNA的阴转率分别为 75 .0 %、6 5 .4%和 5 4.7% ,A组和C组比较差异均有显著性 (P <0 .0 1和P<0 .0 5 )。三组患者近期显效率分别为 70 .8%、5 4.7%和 34 .0 % ;远期显效率分别为 6 4.6 %、5 1.9%和43.4%。A组的近期和远期疗效均显著高于C组 (P <0 .0

一种新型重组人复合α干扰素的表达、分离纯化及活性测定

为提高重组复合α干扰素的活性和半衰期,在现有复合α干扰素结构基础上进行氨基酸替换,合成了新型干扰素(N-cIFN)基因,将该基因克隆到温控表达质粒pBV220,转化大肠杆菌BL21获得工程菌BL21/pBV220-cIFN,经过诱导表达、包涵体变性、DEAE Sephadex A-25柱层析、Sephadex G-50柱层析以及离心超滤等分离纯化过程,获得纯度为92%的重组人复合α干扰素,对其效价测定结果显示其体外活性为9×108IU/mg。