堆型艾美耳球虫子孢子表面抗原基因cSZ1的克隆及序列分析

根据已报道的堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计特异性引物,以孢子化12h的E.acervulina广东株卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了其子孢子表面抗原基因cSZ1(cSZ1(Gd))的cDNA。所克隆cSZ1(Gd)的cDNA全长940bp,其中第3～512位是其阅读框架,共编码170个氨基酸,两端为非编码区。与已报道的cSZ1基因的cDNA序列相比,cSZ1(Gd)有4个位置的核苷酸发生了变异,即原序列中第294、443、569、586位的G、G、G、A在cSZ1(Gd)分别为A、A、A、G,二者核苷酸序列的同源性为99.57%(936/940),其中阅读框架的核苷酸同源性为99.61%(508/510)。比较根据核苷酸序列推导的氨基酸序列,第294位的变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸(V)变为异亮氨酸(I),而第443位的变异则为无义突变,氨基酸序列的同源性为99.41%(169/170)。

堆型艾美耳球虫cSZ1基因的克隆与分析

[目的]分析堆型艾美尔球虫cSZ1基因序列,为研制球虫疫苗提供候选抗原。[方法]根据堆型艾美尔球虫基因序列,设计合成引物,RT-PCR扩增堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因并测序。[结果]与GenBank中发表的堆型艾美尔球虫cSZ1基因序列相比,堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因发生了5个核苷酸变异,两者的核苷酸序列同源性为99.47%,两者编码区的核苷酸序列同源性为99.61%。堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因ORF内有2个变异位点。其中,A185G变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸。[结论]cSZ1基因编码蛋白可以作为球虫疫苗的候选抗原。

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a(+) ,构建了重组表达质粒 pET 32a(+) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 。

堆型艾美耳球虫cSZ1基因重组卡介苗的抗球虫保护效果

本试验将已构建的含有堆型艾美耳球虫cSZ1基因的重组卡介苗p MV361-cSZ1分别以滴鼻、口服和颈部皮下注射的方式免疫雏鸡,经检测各组体液和细胞免疫水平、OPG、相对增重率及ACI等指标,对重组卡介苗的抗球虫保护效果做出评价,为制备相关疫苗的研究奠定基础。

堆型艾美尔球虫cSZ1基因在PMV361整合载体的构建

目的:构建PMV361-cSZ1载体,研制鸡球虫疫苗。方法:根据堆型艾美尔球虫基因序列,设计合成引物,扩增cSZ1基因,在pMD18-T Simple Vector表达后提取质粒,经过PCR鉴定和酶切鉴定。将cSZ1基因片段和PMV361载体由限制性内切酶PvuⅡ和ClaI双酶切后,进行DNA连接。结果:经PT-PCR扩增出cSZ1基因片段,大小为940bp,连接到整合表达载体PMV361中,成功构建PMV361-cSZ1的整合表达载体。结论:成功扩增了堆型艾美耳球虫cSZ1基因开放阅读框并构建了整合表达载体pMV361-cSZ1,为构建鸡球虫重组卡介疫苗内表达提供前期实验基础。

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。

堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的制备及其免疫效果评价

目的制备堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)重组亚单位疫苗,并评价其免疫效果。方法将堆型艾美耳球虫的保护性抗原基因cSZ1克隆至酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-cSZ1,转化毕赤酵母菌株GS115,构建重组菌GS115-pPICZαA-cSZ1,经甲醇诱导表达重组蛋白cSZ1。按20、40、60μg/只(低、中、高剂量)经雏鸡肌肉注射重组蛋白,7 d后进行加强免疫,加强免疫7 d后经口感染E.acervulina孢子化卵囊,剂量为1×10^(4)个/只,同时设阳性对照组(未免疫仅攻虫)和阴性对照组(未免疫未攻虫)。攻虫后7 d检测雏鸡的抗球虫指数(anticoccidial index,ACI);初次免疫后7 d及加强免疫后7 d,经雏鸡心脏采血,分离血清,间接ELISA法检测血清抗体水平;攻虫后7 d,无菌取雏鸡脾脏,CCK-8法检测T淋巴细胞增殖情况。结果经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒构建正确;经菌落PCR及测序鉴定,证明重组菌构建正确。重组蛋白cSZ1的相对分子质量约19000,可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。低、中、高剂量免疫组的ACI分别为171.25、176.42、174.33;与阴性对照组比较,低、中、高剂量免疫组雏鸡于初次免疫后7 d及加强免疫后7 d,血清抗体水平明显升高(P<0.01),攻虫后7 d,T淋巴细胞增殖率显著升高(P<0.01)。结论制备的堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗对雏鸡有较好的免疫效果。