Circ_ZFYVE1对胰岛β细胞周期和自噬的影响

目的:观察Circ_ZFYVE1(cZFYVE1)对小鼠胰岛β细胞(MIN6)周期和自噬的影响。方法:Sanger测序分析验证cZFYVE1的环化位点;MIN6细胞分为正常组(NC,含葡萄糖浓度5.5 mmol/L)、高糖1组(HG1,含葡萄糖浓度15 mmol/L)和高糖2组(HG2,含葡萄糖浓度25 mmol/L)进行培养48 h,qRT-PCR法检测NC组、HG1组和HG2组cZFYVE1表达水平;慢病毒转染实验构建空载体组(sh-NC)、稳定过表达cZFYVE1组(circ-ZFYVE1)和稳定敲低cZFYVE1组(si-cZFYVE1)。qRT-PCR法检测转染后各组MIN6细胞中cZFYVE1基因的表达量;流式细胞术检测各组细胞周期百分率;透射电子显微镜观察各组细胞自噬小体和细胞器的变化;免疫荧光法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1荧光强度;Western Blot法检测各组细胞周期调节蛋白Cyclin D1以及自噬相关蛋白Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ的表达水平。结果:Sanger测序证实cZFYVE1存在环化剪接位点。qRT-PCR结果显示,与NC组相比,HG1组和HG2组cZFYVE1表达水平降低,HG2组cZFYVE1水平较HG1组表达降低(P<0.01)。与sh-NC组比较,circ-ZFYVE1组cZFYVE1表达升高,si-cZFYVE1组cZFYVE1表达降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与sh-NC组比较,circ-ZFYVE1组G1期细胞百分率降低,S期细胞百分率升高,G2期细胞百分率升高,si-cZFYVE1组G1期细胞百分率升高,S期细胞百分率降低,G2期细胞百分率降低(P<0.01)。透射电镜结果显示,与sh-NC组比较,si-cZFYVE1组自噬体减少。免疫荧光结果显示,与sh-NC组比较,circ-ZFYVE1组自噬相关蛋白Beclin-1免疫荧光强度升高,si-cZFYVE1组Beclin-1免疫荧光强度降低(P<0.01)。Western blot结果显示,与sh-NC组比较,circ-ZFYVE1组细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达水平升高,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达水平升高,P62表达水平降低,si-cZFYVE1组Cyclin D1蛋白表达水平降低,Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低,P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:Circ_ZFYVE1可能促进MIN6胰岛β细胞自噬并影响细胞周期。

Circ_ZFYVE1对胰岛β细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的观察Circ;FYVE1(cZFYVE1)对小鼠胰岛β细胞瘤(MIN6)增殖、迁移和凋亡的影响。方法 MIN6细胞分为正常对照组(NC)和高糖组(HG)。NC、HG组分别在含有5.5、25 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基中培养48 h。q RT-PCR检验cZFYVE1表达。Sanger测序对cZFYVE1反向剪接位点的PCR产物进行验证。慢病毒转染实验分为空载体组(Con)组、敲低环状质粒载体组(cZFYVE1-si)和过表达环状质粒载体组(cZFYVE1-OE)。Con组使用空载体进行转染,cZFYVE1过表达和敲低环状质粒载体转染MIN6胰岛β细胞株。qRT-PCR检测转染后各组MIN6细胞系中c ZFYVE1表达水平;CCK8法、EDU法检测细胞增殖;划痕实验检测各组24 h划痕愈合率;流式细胞术检测细胞凋亡率,Westernblot法检测Caspase-3蛋白表达水平。结果 HG组cZFYVE1表达低于NC组[(0.7169±0.1525)vs(1.0000±0.0000),P<0.05]。Sanger测序证实cZFYVE1反向剪接位点。与Con组比较,cZFYVE1-si组cZFYVE1表达、EDU阳性率、24 h及48 h细胞增殖活力、24 h划痕愈合率降低(P<0.05),cZFYVE1-OE组cZFYVE1表达、EDU阳性率、24 h及48 h增殖活力、24 h划痕愈合率升高(P<0.05)。与Con组比较,cZFYVE1-si组MIN6细胞凋亡率、Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05),cZFYVE1-OE组MIN6细胞凋亡率、Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 cZFYVE1可促进MIN6胰岛β细胞增殖、迁移并减少凋亡。