ECV304内皮细胞株的钙激活非选择性阳离子通道及肿瘤坏死因子-α的抑制作用

目的 研究人脐静脉内皮细胞株 ECV304的钙激活非选择性阳离子通道的特征和肿瘤坏死因子-α (TNF-α )对该通道的调控作用。方法 膜片箝细胞贴附式单通道和全细胞方式记录通道活动。结果 内皮细胞膜的单通道活动可被钙离子激活，通道电导γ =(19.74± 2.35)pS(n=7)，通道平均开放概率 Po=0.260± 0.006(n=5)。通道活动可被 TNF-α抑制，表现为通道电导和开放概率降低，分别为γ 1=(10.69± 4.68)pS(n=5)， Po1=0.230± 0.050(n=5)。用膜片箝的全细胞记录所得结果与单通道记录一致。通道活动还可被氯通道阻断剂蒽 9羧酸 (Anthracene-9-Carboxylic acid, A9C)显著地抑制，将电极液中的 KCl和 NaCl用 K-Aspartate置换，电极液不含氯离子，也记录到单通道活动。其单通道电导为 (18.33± 2.98)pS(n=8)，通道活动也能被 TNF-α和 A9C所抑制，但不能被另一氯通道阻断剂 ZnSO4所抑制。又置换 K-Aspartate为 CsCl未记录到未置换溶液前的结果。 Cs＋难以通过此通道，提示所记录到的通道活动不是钙激活氯通道 ICl(Ca)，而是钙激活非选择性阳离子通道。结论 内皮细胞株 ECV304的非选择性阳离子通道可被肿瘤坏死因子 TNF-α和 A9C所抑制。

HCN1通道基因敲除下调小鼠膀胱Cajal间质细胞中BK通道的表达及功能

目的观察小鼠HCN1通道基因敲除对其膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中BK通道的表达和功能的影响,探讨这种影响对膀胱兴奋性调控的意义。方法健康清洁成年的野生型C57BL/6J小鼠和HCN1通道基因敲除的C57BL/6J小鼠各48只(雌雄各半)分别记为正常组和敲基因组,反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR(Q-PCR)、Western blot和免疫荧光双标检测其膀胱ICCs中BK通道各亚基的表达变化,离体逼尿肌肌条实验检测加入BK通道阻滞剂IBTX前后肌条收缩的变化,激光共聚焦显微镜下检测分别加入BK通道激动剂NS1619、阻滞剂IBTX前后小鼠膀胱ICCs内钙荧光的变化。结果 Q-PCR显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、β4各亚基表达均降低(P<0.01);Western blot显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、β4亚基表达均降低(其中α、β3、β4:P<0.01;β1、β2:P<0.05);免疫荧光双标显示敲基因组小鼠膀胱ICCs中BK通道α亚基表达降低(P<0.01);离体逼尿肌肌条实验显示加入IBTX后敲基因组和正常组肌条收缩幅度均变大(P<0.01,P<0.05),且敲基因组肌条收缩幅度的变化值小于正常组(P<0.05);激光共聚焦显微镜下可见加入NS1619后两组ICCs内钙荧光均降低(P<0.05)、加入IBTX后两组ICCs内钙荧光均增强(P<0.01),且不论加入激动剂或阻滞剂,敲基因组加药前后ICCs内钙荧光的变化值均小于正常组(P<0.01)。结论小鼠HCN1通道基因敲除下调了其膀胱ICCs中BK通道的表达及功能,这种下调可能是对HCN1通道基因敲除后膀胱收缩减弱的一种代偿。

大鼠脊髓背角胶状质神经元的去极化反跳及调控机制

目的研究大鼠脊髓背角胶状质(SG)神经元的去极化反跳及调控机制,以期对去极化反跳相关疾病的临床治疗提供参考。方法选取3~5周龄SD大鼠,制作离体脊髓纵切片,应用全细胞膜片钳技术记录SG神经元的电生理学特点及接受超极化刺激后的反应,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道阻断剂和T型钙(Cav3)通道阻断剂对去极化反跳的作用。结果共记录了63个SG神经元的电活动,其中23个无去极化反跳,19个为去极化反跳无放电,21个为去极化反跳伴放电。无去极化反跳组SG神经元的动作电位阈值(-28.7±1.6 m V)明显高于去极化反跳伴放电组(-36.0±2.0 m V)(P<0.05)。HCN通道阻断剂氯化铯和ZD7288可显著延长去极化反跳伴放电的潜伏期,分别从45.9±11.6 ms增加到121.6±51.3 ms(P<0.05)和从36.2±10.3 ms增加到73.6±13.6 ms(P<0.05);ZD7288也能显著延长去极化反跳不伴放电的潜伏期,从71.9±35.1 ms增加到267.0±68.8 ms(P<0.05),而T型钙通道阻断剂氯化镍和米贝地尔可显著降低去极化反跳伴放电的振幅,分别从19.9±6.3 m V降到9.5±4.5 m V(P<0.05)和从26.1±9.4 m V降到15.5±5.0 m V(P<0.05),米贝地尔同样能显著降低去极化反跳不伴放电的振幅,从14.3±3.0 m V降低至7.9±2.0 m V(P<0.05)。结论近2/3的SG神经元有去极化反跳,其潜伏期和振幅分别受HCN通道和T型钙通道调控。

静水压对人膀胱平滑肌细胞内钙离子浓度及香草型瞬时受体电位表达的影响

目的研究静水压作用下人膀胱平滑肌细胞(human bladder smooth muscle cells,hb-SMCs)内游离钙离子浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)的变化及香草型瞬时受体电位(transient receptor potential vanilloid,TRPV)基因的表达情况,初步探讨机械应力在介导hb-SMCs增殖中的分子机制。方法取第6～7代细胞进行实验,采用新型Ca2+荧光染色剂Fluo-3/AM负载hb-SMCs,应用倒置激光扫描共聚焦显微镜分别测定静水压加压0 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)(A组)、200 cm H2O作用30 min(B组)及撤销200 cm H2O静水压(C组)后hb-SMCs内[Ca2+]i。采用RT-PCR技术测定200 cm H2O静水压作用0、2、6、12、24 h时TRPV1、TRPV2及TRPV4基因mRNA的表达量。结果 A、B、C组hb-SMCs内[Ca2+]i分别为(100.808±1.724)、(122.008±1.575)、(99.918±0.887)U,B组[Ca2+]i明显高于A、C组(P<0.001),C组撤销200 cm H2O静水压力后[Ca2+]i下降至A组基线水平(t=0.919,P=0.394)。RT-PCR检测示,200 cm H2O静水压加压0 h组、2 h组、6 h组、12 h组及24 h组TRPV1、TRPV2及TRPV4在hb-SMCs中均有表达,随时间推移表达无明显变化;各组间TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论高水平静水压作用下hb-SMCs内[Ca2+]i明显升高。作为可能表达为机械敏感性阳离子通道的TRPV1、TRPV2及TRPV4基因在hb-SMCs中均有表达,机械应力可能通过调节其开放量而非上调其表达量使hb-SMCs内[Ca2+]i升高。