siCASK重组载体构建及效应检测

目的 构建针对人CASK基因的siRNA质粒 ,建立CASK下调表达的细胞模型 ,为CASK相关的细胞信号研究奠定基础。方法 选择人CASK基因不同靶点 ,体外合成DNA模板 ,经退火后插入到pSilencer3 .1hygro载体的多克隆位点。阳性重组质粒转染ECV3 0 4细胞 ,蛋白印迹。观察siCASK对目的蛋白表达的抑制效率。结果 酶切、测序表明以pSi lencer3 .1hygro为载体的重组质粒siCASK构建成功。siCASK转染细胞后 ,能够明显抑制目的蛋白的表达。结论 成功构建了siRNA重组质粒 ,为下一步CASK功能研究奠定基础。

植物调控盐胁迫下离子动态平衡

在盐胁迫下,植物在细胞质溶胶中维持高浓度的K+和低浓度的Na+。植物通过调控K+和Na+转运蛋白和为这些转运蛋白提供转运动力的H+泵蛋白活性及其表达量来维持。尽管盐胁迫感受器蛋白仍不清楚,但是已明确鉴定其信号转导的一些中介化合物。迹象表明,一类蛋白激酶化合物SOS3和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2能够被盐胁迫引起的钙信号激活。其CBL/CIPK复合物随后磷酸化和激活多种离子转运蛋白,例如位于细胞膜上的Na+/H+反转运蛋白SOS1。

Akt-Kv4.3-CaMKⅡ在有氧运动抑制压力负荷小鼠心肌肥厚中的作用及其机制

目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)-离子通道Kv4.3(Kv4.3)-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信号通路在有氧运动抑制压力负荷小鼠心肌肥厚中的作用及其机制。方法 60只实验小鼠均分为5组:假手术(SHAM)组、主动脉缩窄手术(TAC)组、假手术+有氧运动(SHAM+E)组、主动脉缩窄术+有氧运动(TAC+E)组,主动脉缩窄术+有氧运动+Akt抑制剂Perifosine(TAC+E+Peri)组。高分辨率小动物超声系统评价小鼠心功能及肥厚程度,麦胚凝集素(WGA)染色检测心肌细胞横截面积;荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ANP表达,Western blot检测蛋白心房钠尿肽(ANP)、p-Akt、Kv4.3、p-CaMKⅡ表达水平。结果与SHAM组相比,TAC促进心肌肥厚,恶化心功能(P<0.01)。给予有氧运动训练后,TAC+E组较TAC组小鼠心功能改善,心肌肥厚程度减轻(P<0.01)。同时Western blot检测显示,TAC组较SHAM组p-Akt、Kv4.3表达降低,p-CaMKⅡ上调(P<0.01);TAC+E组p-Akt和Kv4.3表达较TAC小鼠增加,p-CaMKⅡ下调(P<0.01)。而给予Akt抑制剂Perifosine后,相比于TAC+E组,TAC+E+Peri组心功能恶化、心肌肥厚程度和ANP表达增加,心肌细胞横截面积增大,同时伴随Kv4.3表达降低、p-CaMKⅡ增高(P<0.01)。结论有氧运动训练能够通过调节Akt-Kv4.3-CaMKⅡ信号通路抑制压力负荷心肌肥厚。

阿托伐他汀预处理对小鼠肠缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系

目的探讨阿托伐他汀预处理对小鼠肠缺血再灌注损伤的影响及其与1-磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的关系。方法健康雄性C57BL/6小鼠24只,6~8周龄,体重18~22 g,采用随机数字表法分为4组(n=6):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、阿托伐他汀预处理组(A组)和阿托伐他汀+PI3K抑制剂LY294002组(AL组)。A组和AL组阿托伐他汀10 mg/kg连续灌胃3 d,AL组于阿托伐他汀末次灌胃前30 min腹腔注射LY2940020.3 mg/kg。随后采用夹闭肠系膜上动脉45 min再灌注2 h的方法,建立小鼠肠缺血再灌注损伤模型,S组只分离肠系膜上动脉不夹闭。于再灌注2 h后处死小鼠,取小肠组织,HE染色后光镜下观察病理学结果,测定肠组织Chiu评分和湿重/干重比值,Western blot法检测肠组织PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)、自噬蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达,计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与S组比较,I/R组、A组和AL组肠组织Chiu评分和湿重/干重比值升高,PI3K和p-Akt下调,Beclin-1表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05);与I/R组比较,A组肠组织Chiu评分和湿重/干重比值降低,PI3K和p-Akt表达上调,Beclin-1表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。与A组比较,AL组肠组织Chiu评分和湿重/干重比值升高,PI3K和p-Akt表达下调,Beclin-1表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀预处理可减轻小鼠肠缺血再灌注损伤,其机制与激活PI3K/Akt信号通路,抑制自噬水平有关。

WNK3激酶对肾脏大电导钙激活钾通道的调节作用及机制

目的探讨WNK3激酶对肾脏大电导钙激活钾通道（Maxi K通道）的调节作用及其机制。方法（1）在非洲绿猴肾成纤维细胞（Cos-7细胞）中转染0．5μg Maxi K质粒的同时分别转染0、0．6、1．2、1．8μg WNK3质粒，Western印迹检测细胞总蛋白中Maxi K通道的表达及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）的磷酸化水平。（2）Cos-7细胞分为转染2．5μg Maxi K质粒组（对照组）和转染2．5μg Maxi K质粒＋2．5μg WNK3质粒组（实验组），细胞表面生物素化方法检测细胞表面膜蛋白中Maxi K通道的表达，免疫沉淀和Westem印迹检测Maxi K通道蛋白泛素化水平。（3）用WNK 3siRNA沉默WNK3激酶基因，用质子泵抑制剂（Baf—A1）阻断溶酶体降解途径，Cos-7细胞分为Maxi K＋阴性对照siRNA组、Maxi K＋WNK3 siRNA组和Maxi K＋WNK3 siRNA＋Baf-A1组。Western印迹检测细胞中Maxi K通道蛋白的表达。结果（1）与0μg WNK3质粒组比较，转染0．6、1．2、1．8μg WNK3质粒组细胞总蛋白中Maxi K通道的表达均升高，MAPKERKl／2的磷酸化水平均降低（均P〈0．01），且呈剂量依赖性。（2）与对照组比较，同时转染WNK3和Maxi K的实验组细胞总蛋白和膜蛋白中Maxi K通道的表达均增加，Maxi K通道蛋白的泛素化水平降低（均P〈0．01）。（3）与Maxi K＋阴性对照siRNA组比较，Maxi K＋WNK 3siRNA组Maxi K蛋白表达降低（P〈0．01），Maxi K＋WNK 3siRNA＋Bar-A1组的Maxi K蛋白表达无明显变化（P〉0．05）；与Maxi K＋WNK 3siRNA组比较，Maxi K＋WNK 3siRNA＋Baf—A1组的Maxi K蛋白表达升高（P〈0．01）。结论WNK3激酶通过减少Maxi K通道蛋白的泛素化来抑制Maxi K通道的溶酶体降解途径，从而促进Maxi K通道在细胞内和细胞膜上的表达量。其机制可能与MAPK ERK1／2转导通路有关。