A Highly Sensitive Detection Method, Phos-tag^TMAffinity SDS-PAGE, Used to Analyze a Possible Substrate of CDPK-Related Protein Kinase5 in <i>Arabidopsis</i>

Phosphorylation of proteins is an important post-translational modification. Methods to determine the phosphorylation state of proteins are very important to evaluate diverse biological processes. CRK5 is the CDPK-related protein kinase in Arabidopsis, WD-repeat protein (WDRP) might be CRK5-interact-protein based on Y2H results. Here, we used bimolecular fluorescence complementation (BiFC) further to study and visualize the interaction between CRK5 and WDRP in living cells. Then, we combined Phos-tagTM SDS-PAGE with western blot (WB) analysis, using WDRP antibody and the anti-6×His antibody, to detect phosphorylated WDRP. This approach confirmed that WDRP might be phosphorylated by CRK5 in vitro. Site mutation analysis suggested that serine-70 might be the amino acid phosphorylated by CRK5 in WDRP. Cell extracts isolated from WT, OERK5, and crk5 used to analyze the kinase reaction using recombinant WDRP as substrate. These results demonstrated that WDRP was phosphorylated by cell extracts and that there may be additional kinases that phosphorylate WDRP in Arabidopsis. Phos-tagTM SDS-PAGE thus provides a suitable and convenient method for analysis of phosphorylation in plants.

陆地棉钙依赖蛋白激酶GhCDPK28-A10参与抗黄萎病的功能分析

【目的】解析GhCDPK28-A10在棉花黄萎病反应中的作用机制,并为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得Gh CDPK28-A10基因同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测在经大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)或H_(2)O_(2)处理的棉株中GhCDPK28-A10基因的表达量变化。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术验证GhCDPK28-A10在棉花抗黄萎病中的作用。【结果】进化树和基因结构分析表明,陆地棉中GhCDPK28-A10的6个同源蛋白具有相似数量的基序和CDPK家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域;启动子区域的序列分析发现GhCDPK28-A10包含响应茉莉酸(jasmonic acid,JA)的顺式作用元件。组织特异性表达分析表明GhCDPK28-A10在根、茎和真叶中均表达,且在真叶中表达水平最高。在大丽轮枝菌、MeJA和H_(2)O_(2)胁迫下,GhCDPK28-A10的表达量显著升高。VIGS沉默Gh CDPK28-A10的棉株中抗病相关基因PR1、NPR1、PR4表达增强;JA合成负调控基因JAZ1表达量降低,说明随着CDPK28-A10表达水平的降低,JAZ1对JA合成的抑制作用减弱,活性氧富集,进而增强棉株的黄萎病抗性。【结论】GhCDPK28-A10通过调控防御相关基因的表达,负向调控棉花对黄萎病的抗性反应,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

梨CDPK基因家族全基因组序列鉴定分析

CDPK是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，在介导植物生育信号和逆境信号转导中具有重要作用。为揭示CDPK基因在梨生长发育与抗逆防御机制中的作用，本研究通过生物信息学手段，结合梨基因组注释信息，鉴定梨基因组中CDPK家族基因成员，利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树；利用per1程序以及GSDS工具进行基因结构与保守性分析，为植物CDPK基因功能分析与利用提供依据。结果表明，本研究成功鉴定出26个CDPK家族成员，根据系统发育树分析，所有PbCDPK被分为4类；基因结构预测结果表明，大多数PbCDPK均含有6～7个内含子；且预测的PbCDPK氨基酸序列绝大多数含4个EF-hand功能域；为了深入分析梨与其他物种的同源进化关系，构建了梨与拟南芥、水稻的CDPK基因系统进化树，进化树聚类分析结果将所有的CDPK蛋白分为四类。综上所述，目前已初步获得26个梨CDPK基因，为在基因组范围内研究CDPK基因在梨生长发育与逆境响应中的功能奠定了基础。

小桐子CDPK及相关激酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

基于小桐子基因组数据库,在全基因组水平对小桐子CDPK及相关激酶基因家族进行鉴定,并对其系统进化、基因结构、保守结构域、染色体定位以及器官与低温胁迫表达进行分析,为深入开展小桐子CDPK及相关激酶基因的功能鉴定及其在小桐子遗传改良中的应用提供依据。利用CDPK结构域的隐马尔可夫模型对小桐子蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得小桐子CDPK及相关激酶基因家族成员。利用不同的工具对CDPK及相关激酶基因进行生物信息学对比分析。通过小桐子器官与低温表达谱数据进行CDPK及相关激酶基因的表达分析。小桐子基因组中共检索到17个CDPK基因、5个CRK基因、2个PPCK基因、4个PEPRK基因以及1个CCaMK基因,各基因家族成员的基因长度、蛋白质等电点及亚细胞定位等理化参数具有家族特异性。序列比对与系统进化分析显示,5个基因家族都单独聚类,而CDPK与PEPRK基因家族又分别聚类为4个与2个亚族,且鉴定到小桐子CDPK家族成员的N-端可变区、激酶结构区、自抑区及EF-hand调控区4个保守结构域以及其他激酶成员的激酶结构域。同时,分别有21个与24个CDPK及相关激酶可能发生N-豆蔻酰化与N-十六烷酰化的修饰。染色体定位表明,小桐子CDPK及相关激酶基因不均匀地分布于10条染色体上,且存在JcCDPK7/JcCDPK9串联复制现象。转录组表达分析表明,29个CDPK及相关激酶基因中,有24个基因在叶片、根及种子中都有表达,而JcCDPK3、JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK属于低温诱导高表达基因,与小桐子的抗冷性直接相关。

小麦幼胚脱分化过程中CDPKs基因的差异表达分析

为了解研究蛋白激酶（CDPKs）在小麦幼胚脱分化过程中的作用,利用Affymetrix小麦基因芯片检测了小麦幼胚脱分化过程中CDPKs基因的表达变化。结果表明,在检测到的16个CDPKs基因中,有13个基因在小麦幼胚脱分化过程中发生了有意义的变化,其中上调表达基因有5个,上调2-6.5倍,下调表达基因有8个,下调2-16倍。根据已知CDPKs生物功能和它们表达变化趋势以及这些变化趋势与脱分化过程中的吻合程度分析结果,推测CPK6、BJ286005、CK211705、BJ274015和BJ246895参与了小麦幼胚脱分化过程的启动和愈伤组织的形成。

西瓜CDPK基因家族鉴定与特征分析

以CDPK基因家族成员基因信息为数据源,采用生物信息学技术,对其基因及氨基酸序列特征进行分析,以期为西瓜CDPK蛋白生物学功能的深入研究提供参考。结果表明:在西瓜中共鉴定出22个CDPK家族成员,所有的ClCDPK被分为4类,多数ClCDPK均含有6~7个内含子;氨基酸序列中含有4个EF-手型结构;在与模式植物拟南芥进行同源进化分析中,系统进化树聚类分析将所有的ClCDPK基因家族全部分为4类。

柑橘溃疡病抗性SNP验证及其相关钙依赖性蛋白激酶基因诱导表达

【目的】前期根据转录组数据挖掘柑橘单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,通过关联分析获得14个与柑橘溃疡病耐/感性关联的SNP。以此为基础,本研究利用柑橘杂交群体验证这些位点与柑橘溃疡耐/感性的相关性,以期获得显著相关的SNP,并对其相关的基因进行柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)和植物激素诱导表达分析。【方法】以抗病和敏感柑橘品种及其杂交F1代群体共143个材料为试材,采用离体叶片针刺接种法进行溃疡病抗性鉴定;利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术,对F1群体进行SNP分型;使用DPS软件对F1群体的溃疡病耐/感性表型和SNP基因型进行相关分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析其中一个SNP相关的柑橘钙依赖性蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase gene,CDPK)的诱导表达模式。【结果】供试杂交F1代群体的病斑面积在0.75—3.29 mm2;病情指数在30.2—100,而抗病品种‘金弹’病情指数为11.1,敏感品种‘冰糖橙’病情指数为100。病情指数较低的杂交后代,其亲本至少有1个为耐病性品种,母本耐病性强的居多。根据病情指数确定免疫材料1个,高抗17个,中抗31个,中感38个,高感56个。SNP分型结果显示,14个SNP位点在143个供试材料间均有多态性,可分为3种不同的基因型,2种纯合型和1种杂合型。简单相关分析结果表明,多个SNP位点的基因型与病斑面积及病情指数相关性显著。典型相关分析结果显示,其中5个SNP位点与病斑面积相关性较高,相关系数绝对值均>0.2,其编号分别为HP31、HP42、HP85、HP87、HP170,可利用这5个SNP位点的基因型预测柑橘溃疡病耐性的强弱。其中SNP位点HP31位于CsCDPK(CAP ID:Cs4g10370)的编码区,对柑橘离体叶片接种溃疡病菌诱导处理6、12、24、48和72 h后进行基因相对表达量分析,发现‘金弹’(高抗)、‘新生系3号椪柑’(中抗)和‘冰糖橙’(高感)中该基因的表达量均呈先升后降趋势,且均在48 h其相对表达量达到最高;接菌处理后12 h,‘金弹’中该基因的相对表达量为对照的3倍,而‘新生系3号椪柑’和‘冰糖橙’中无明显差异。此外,CsCDPK受水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达,且在不同溃疡病耐/感性品种中该基因诱导表达的模式不同。【结论】获得5个与溃疡病耐/感性显著相关的SNP,可用作柑橘溃疡病耐/感性筛选标记。SNP位点HP31相关的CsCDPK受溃疡病菌和SA、MeJA和ABA诱导表达,该基因可能在柑橘应答溃疡病菌侵染的信号转导过程中具有重要功能。

小麦成熟胚脱分化过程CDPKs基因的差异表达分析

用Affymetrix小麦基因芯片检测小麦成熟胚脱分化过程中CDPKs基因的表达变化的结果表明,在检测到的16个CDPKs基因中,有15个基因在小麦成熟胚脱分化过程中发生了有意义变化,其中上调表达基因有12个,上调2～7.5倍,下调表达基因有2个,下调3～6.1倍,在不同时点既有上调又有下调的1个。根据已知CDPKs生物功能和它们表达变化趋势以及这些变化趋势与脱分化过程中的吻合程度分析结果,推测CPK2A、CPK2B、CPK6和Os12g0169800基因参与了小麦成熟胚脱分化过程的启动和愈伤组织的形成。