miRNA-208a-3p过表达致慢性心衰大鼠心肌细胞线粒体钙超载和功能障碍的机制研究

目的观察miRNA-208a-3p在慢性心力衰竭大鼠心肌中的表达水平,探讨其在线粒体钙稳态和线粒体功能方面的调节机制。方法35只健康SD大鼠,随机分为模型组(n=20)和对照组(n=15),模型组采用腹主动脉直径缩窄法建立慢性心衰模型,对照组行假手术。通过心功能和组织病理学检测评价模型,测定心肌miR-208a-3p表达,心肌线粒体去乙酰化酶3(SIRT3)蛋白和NADH脱氢酶亚基1(ND1)蛋白表达、线粒体Ca2+水平、心肌细胞活性氧(ROS)生成。结果模型组大鼠心肌miR-208a-3p表达水平显著高于对照组(P<0.05),SIRT3蛋白表达显著低于对照组(P<0.001),且miR-208a-3p与SIRT3表达呈显著负相关;模型组ND1蛋白表达显著低于对照组(P<0.05),且ND1与SIRT3表达呈显著正相关;模型组心肌细胞线粒体内Ca2+水平显著高于对照组(P<0.05),心肌细胞ROS生成也显著高于对照组(P<0.05)。结论慢性心衰心肌组织miR-208a-3p过度表达与SIRT3/ND1活性降低相关,抑制线粒体呼吸链活性,此外,心肌细胞出现线粒体钙超载和ROS生成增加,进一步加剧线粒体呼吸功能障碍,是慢性心衰线粒体功能障碍的重要机制。

乌头碱配伍甘草次酸前后对衰竭心肌细胞影响的比较研究

目的比较乌头碱配伍甘草次酸前后对衰竭心肌细胞的影响。方法将H9c2细胞随机分为9组,即空白组,模型组,甘草次酸组,30、120、480μmol·L^(-1)乌头碱组,30μmol·L^(-1)联用组(30μmol·L^(-1)乌头碱+30μmol·L^(-1)甘草次酸)、120μmol·L^(-1)联用组(120μmol·L^(-1)乌头碱+30μmol·L^(-1)甘草次酸)、480μmol·L^(-1)联用组(480μmol·L^(-1)乌头碱+30μmol·L^(-1)甘草次酸)。除空白组外,各组均以阿霉素法构建衰竭H9c2心肌细胞模型。造模成功后,空白组和模型组给予DMEM,其余各组给予相应药物干预24 h。显微镜观察细胞形态和线粒体微观结构,CCK-8法测定细胞存活率,ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、Na+-K+-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、ATP,荧光探针法测定活性氧(reactive oxygen species,ROS)、膜电位、胞内及线粒体内Ca^(2+)浓度。蛋白免疫印迹法(western blot,WB)检测AMPK通路和CaMKⅡ通路蛋白。结果与模型组比较,120、480μmol·L^(-1)乌头碱降低细胞存活率,升高MDA含量(P<0.01);480μmol·L^(-1)乌头碱破坏线粒体结构;30、120、480μmol·L^(-1)乌头碱升高ROS含量,降低SOD、CAT、GSH酶活性,降低线粒体膜电位和ATP生成,升高胞内及线粒体内钙离子浓度,降低Na+-K+-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性(P<0.05或P<0.01);480μmol·L^(-1)乌头碱抑制AMPK磷酸化,降低SERCA2a和PGC-1α蛋白表达,促进RyR2蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。与单用乌头碱比较,配伍甘草次酸改善其线粒体结构损伤,降低ROS含量,升高SOD、CAT、Na+-K+-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性,降低胞内及线粒体内的钙离子浓度(P<0.05或P<0.01);30、120μmol·L^(-1)联用组升高线粒体膜电位(P<0.05或P<0.01);120、480μmol·L^(-1)联用组降低MDA含量,提高GSH、Ca^(2+)-ATP酶活性,升高ATP含量(P<0.05或P<0.01);480μmol·L^(-1)联用组可抑制CaMKⅡ磷酸化,升高PGC-1α蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论甘草次酸可拮抗乌头碱对衰竭心肌细胞的线粒体毒性,作用环节可能与缓解氧化应激和钙超载,增加线粒体产能有关。

MCU在神经系统中的研究进展

钙离子(Ca^(2+))在细胞的生理活动调控中起到重要作用,包括神经元细胞的能量代谢和细胞死亡方式。线粒体作为细胞的动力工厂,为细胞的一系列生理活动提供能量,线粒体钙对腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的产生至关重要,线粒体内Ca^(2+)失衡会严重影响神经细胞的生理活动。线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)复合体是位于线粒体内膜上的一种Ca^(2+)选择性通道,在维持线粒体内Ca^(2+)的稳态中发挥重要作用,从而影响神经元的正常功能。在神经元树突中,细胞线粒体内Ca^(2+)的改变决定信号分子的释放和传入、神经元的兴奋性和突触可塑性的维持。神经系统疾病包括脑血管疾病、发作性疾病、运动障碍性疾病以及神经系统变性等都和线粒体钙有密不可分的关系。本文主要对MCU复合体的结构、功能、作用以及部分疾病治疗前景的关系进行归纳总结,探讨MCU复合体在神经系统中的作用机制。

CDC25C表达下调的黑色素瘤细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡情况观察

目的探讨细胞分裂周期蛋白25C(CDC25C)对黑色素瘤B16细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡的影响。方法取黑色素瘤B16细胞进行培养,将细胞随机分为转染组、转染对照组、空白对照组。转染组转染CDC25C低表达慢病毒质粒,转染对照组转染慢病毒空质粒,空白对照组正常培养。利用Rhod-2/AM与MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内Ca^(2+)浓度及线粒体活性氧(ROS),RT-qPCR法和Western blotting法分别检测细胞线粒体应激反应相关分子ClpP、LONP1及线粒体途径凋亡相关分子Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果与转染对照组和空白对照组相比,转染组细胞线粒体Ca^(2+)及ROS含量增加,ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或<0.01)。结论CDC25C表达下调激活黑色素瘤B16细胞发生线粒体应激反应,并诱导线粒体途径的细胞凋亡。

基于线粒体钙稳态探讨血府逐瘀汤对冠心病血瘀证模型大鼠的作用机制

目的基于线粒体钙稳态探讨血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证的作用机制。方法150只SD大鼠随机均分为正常组、假手术组(只穿线不结扎)、模型组、阿托伐他汀钙组(0.90 mg/kg·d,以下简称他汀组)以及血府逐瘀汤低、中、高剂量组[3.51、7.02、14.04 g/(kg·d),以下简称低、中、高剂量组],每组6只。除正常组和假手术组外,其他组均通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制备冠心病血瘀证模型,造模成功24 h后灌胃给药,连续灌胃7 d,取各组大鼠左室缺血区心肌组织。HE染色观察样本坏死病变情况;线粒体钙离子探针检测线粒体内钙离子的荧光强度;定磷法检测心肌细胞Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性;免疫组织化学检测心肌组织线粒体钙单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)、心肌肌浆网钙离子ATP酶(sarco/sndoplasmic reticulum Ca^(2+)-ATPase 2a,SERCA2a)、瞬时受体电位通道3(transient receptor potential canonical 3,TRPC3)、钙释放激活钙通道1(calcium release-activated calcium channel protein 1,ORAI1)、半胱氨酸(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3、Caspase-9的蛋白表达。结果与正常组相比,模型组大鼠心肌组织可见细胞排列紊乱,横纹模糊,大量心肌细胞坏死,线粒体Ca^(2+)平均荧光强度、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的AOD值明显升高(P<0.01),Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性、SERCA2a的AOD值明显下降(P<0.01);与模型组相比,他汀组以及血府逐瘀汤各剂量组,心肌细胞水肿程度减轻,炎性细胞浸润减少,细胞排列相对紧密,细胞病理损伤程度有所缓解,他汀组以及血府逐瘀汤各剂量组的SERCA2a的AOD值显著上升(P<0.01),线粒体Ca^(2+)平均荧光强度、MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-9的AOD值显著下降(P<0.05,P<0.01),血府逐瘀汤各剂量组的Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性显著上升(P<0.05,P<0.01)以及Caspase-3的AOD值显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论血府逐瘀汤可以调控冠心病血瘀证模型大鼠心肌线粒体钙离子转运,调节心肌细胞线粒体钙稳态,可能与上调SERCA2a的蛋白表达,下调MCU、TRPC3、ORAI1、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达相关。

心肌缺血再灌注损伤对L-型钙通道自抑制功能的影响

目的探究心肌缺血再灌注(I/R)损伤对L-型钙通道(L-VDCC)自抑制功能的影响及机制。方法采用大鼠离体心脏灌流的方法构建I/R模型,BL-420N生物信号采集与分析系统监测I/R后心脏功能的变化;用CoCl2对急性分离的大鼠心肌细胞造成缺氧损伤,构建细胞I/R模型,并用膜片钳、Co-IP及Western Blot检测L-VDCC的功能变化。结果与缺血0 min组和缺血30 min组相比,缺血60 min组复灌后心脏收缩力降低,心肌电活动减弱;缺氧6 h组和缺氧12 h组相比于缺氧0 h组细胞L-VDCC电流-电压(I-V)曲线峰值增大,稳态激活曲线左移,通道半激活电压(V1/2)增大,稳态激活曲线斜率因子Ka值降低,细胞死亡率增加;Cav1.2结合DCT及CaM的量减少,差异均有统计学意义(P<0.05);PKA、PKG等外源性调节蛋白表达水平无明显变化。结论心肌I/R损伤可引起心肌细胞L-VDCC自抑制功能减弱,Ca2+内流增加,引起细胞钙超载,促进心肌细胞死亡。

基于“内质网-线粒体”互通论心肌梗死后抑郁“瘀虚痰热”之机

双心疾病主要指心脏和心理同病,心肌梗死后抑郁是常见的双心疾病。心肌梗死后,患者容易出现抑郁等不良情绪,而抑郁情绪又是诱发不良心血管事件的重要危险因素。瘀、虚、痰、热作为心肌梗死后抑郁的重要病因,可单独或相兼致病,故临床上常用活血养血、化痰清心之法以达到瘀、虚、痰、热共治的目的。同时,现代医学认为内质网应激引起线粒体相关内质网膜(MAM)钙稳态失衡是导致线粒体钙超载损伤的内在机制,本文从该角度阐释心肌梗死后抑郁的内在机制,为临床治疗提供新的参考。

下调GSK3β通过抑制ITPR1-GRP75-VDAC1复合体功能减轻衰老肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤

目的探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)对衰老小鼠原代肾小管上皮细胞(RTEC)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及其调控机制。方法将RTEC分成为Young组即正常生长的年轻RTEC、Old组即使用Etoposide诱导的衰老RTEC、Old+Ad-shNC+H/R组即使用Etoposide诱导衰老再转染腺病毒阴性对照(AdshNC)后进行H/R处理,Old+Ad-shGSK3β+H/R组即使用Etoposide诱导衰老后再转染靶向沉默GSK3β的短发夹RNA腺病毒(Ad-shGSK3β)后进行H/R处理。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平和线粒体活性氧水平,采用免疫荧光染色法检测各组钙离子水平,采用蛋白质印迹法检测各组GSK3β、线粒体相关的内质网膜(MAM)相关蛋白肌醇1,4,5-三磷酸受体1(ITPR1)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达及磷酸化水平,采用免疫共沉淀分析GSK3β与MAM相关蛋白的相互作用。结果与Young组比较,Old组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较高;与Old组比较,Old+AdshNC+H/R组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较高;与Old+Ad-shNC+H/R组比较,Old+Ad-shGSK3β+H/R组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Young组比较,Old组ITPR1、GRP75和GSK3β总蛋白表达增多,ITPR1和GRP75磷酸化水平升高,而VDAC1总蛋白和磷酸化水平均下降;与Old组比较,Old+Ad-shNC+H/R组GSK3β蛋白表达不变,ITPR1和GRP75总蛋白和磷酸化水平升高,VDAC1总蛋白表达不变,磷酸化水平增高;与Old+AdshNC+H/R组比较,Old+Ad-shGSK3β+H/R组GSK3β蛋白表达减少,ITPR1、GRP75和VDAC1总蛋白表达不变,磷酸化水平均下降。免疫共沉淀结果显示,GSK3β能够与ITPR1、GRP75和VDAC1蛋白发生相互作用。结论GSK3β在衰老RTEC中表达升高,抑制GSK3β表达能够降低ITPR1-GRP75-VDAC1复合体磷酸化水平,限制线粒体钙离子超负荷,保护线粒体功能,减少再灌注时细胞损伤。

下调XBP1s通过抑制ITPR介导的线粒体功能障碍改善肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨剪接型X盒结合蛋白1(XBP1s)对小鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及其作用机制。方法 将小鼠肾小管上皮细胞分为腺病毒阴性对照组(Ad-shNC组)、靶向沉默XBP1s腺病毒组(Ad-shXBP1s组)、Ad-shNC+H/R组、Ad-shXBP1s+H/R组。检测各组细胞凋亡水平、线粒体活性氧活性、线粒体膜电位及线粒体钙离子水平。使用染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)分析XBP1s调控肌醇1,4,5-三磷酸受体(ITPR)家族的结合位点。检测各组XBP1s和ITPR家族信使RNA(mRNA)和蛋白表达水平。结果 与AdshNC组比较,Ad-shNC+H/R组细胞凋亡水平更高,线粒体活性氧水平升高,线粒体膜电位降低,线粒体钙离子水平升高;与Ad-shNC+H/R组比较,Ad-shXBP1s+H/R组细胞凋亡水平较低,线粒体活性氧水平下降,线粒体膜电位升高,线粒体钙离子水平降低(均为P<0.05)。与Ad-shNC组比较,Ad-shXBP1s组XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3 mRNA和蛋白相对表达量降低(均为P<0.05)。与Ad-shNC组相比,Ad-shNC+H/R组XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3蛋白相对表达量升高;与Ad-shNC+H/R组相比,Ad-shXBP1s+H/R组XBP1s、ITPR1、ITPR2和ITPR3蛋白相对表达量下降(均为P<0.05)。ChIP-seq结果显示,XBP1s能够结合ITPR1的启动子和外显子、ITPR2外显子和ITPR3外显子。结论 XBP1s可能通过直接调控ITPR转录和翻译而影响线粒体相关的内质网膜结构功能,下调XBP1s能够抑制ITPR表达,改善线粒体损伤。

腺泡细胞钙离子超载与急性胰腺炎关系的研究进展

急性胰腺炎(AP)是消化科的常见的疾病类型之一,大多数患者病情轻微,但约25%的患者会发展为重症胰腺炎,其中重症胰腺炎的致死率则高达30%~50%。国内诸多对AP病因病机的基础研究显示,使用雨蛙素法、无胆盐乙硫氨酸食物诱导法、胆胰管逆行牛黄胆酸钠注射法诱导的AP动物模型中腺泡细胞内钙离子浓度均持续增高,进而引起胞内钙离子依赖性的酶原颗粒提前活化、空泡形成最终导致细胞凋亡,以上结论均提示腺泡细胞钙离子超载在AP的发生发展中起到至关重要的作用,而针对AP的治疗目前临床上缺乏高效且具有针对性的靶向药物,故探索维持细胞内钙稳态的机制及腺泡细胞钙超载所引起的病理过程,可为研究AP的直接靶向治疗药物提供新思路。该文就细胞内钙稳态与调控、腺泡细胞钙超载的发生、Ca2+超载在AP发病机制中的作用、腺泡细胞Ca2+超载的临床诊治方法的研究进展作一综述。

大豆异黄酮通过抑制Wnt/Ca2+信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注引起的钙超载

目的 探讨大豆异黄酮(SI)减轻脑缺血再灌注(I/R)引起钙超载的作用机制。方法 将48只SD大鼠采用随机数法分为4组:假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注模型组(I/R组)、病毒空载组(NC组)、Frizzled-2敲低组(Knock down组),12只/组。采用线栓法堵塞大脑中动脉2 h,再灌注24 h构建I/R模型。采用Western blot验证病毒敲低效率并检测Wnt/Ca2+信号通路相关蛋白Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ的变化。采用钙含量显色法检测各组缺血半暗带(IP)区钙离子浓度变化,HE检测各组IP区组织结构变化。另将72只SD大鼠采用随机数法分为3组:Sham组、I/R组、大豆异黄酮预处理组(SI组),24只/组。采用多普勒血流仪检测局部脑血流变化,TTC染色检测脑梗死体积,HE和尼氏染色检测IP区组织变化、免疫荧光检测ROS、Ca2+和细胞凋亡水平、流式检测细胞钙离子浓度,试剂盒检测血清MDA和SOD水平,Western blotting和免疫组化检测IP区Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白表达。结果 与I/R组比较,Knock down组钙离子浓度(P<0.001)、Wnt5a(P<0.05)、Frizzled-2(P<0.05)和P-CaMKⅡ(P<0.001)表达水平均降低;与I/R组比较,SI组钙离子浓度(P<0.05)、ROS和MDA水平(P<0.001)、细胞凋亡程度(P<0.001)、脑梗死体积(P<0.001)、Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ表达水平(P<0.05)均降低,SOD水平升高(P<0.001)。结论大豆异黄酮可能通过抑制Wnt/Ca2+信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注引起的钙超载。

压电型机械门控离子通道组件1在大鼠压力性损伤中的作用机制

背景:压力性损伤的发生机制复杂,哪些因素在其发生中起到核心作用,这些因素具体又是如何发生的尚不完全清楚。目的:探讨压电型机械门控离子通道组件1(piezo-type mechanosensitive ion channel component 1,PIEZO1)与压力性损伤发生的关系。方法:①细胞实验:采用不同浓度的PIEZO1激动剂Yoda1干预人永生化角质形成细胞(HaCaT),检测细胞活性、钙离子内流及PIEZO1、凋亡相关蛋白的表达。②动物实验:采用随机数字表法将12只SD大鼠随机分为4组,每组3只:对照组大鼠不进行任何处理,1,2,3 mm组分别采用厚度1,2,3 mm的磁铁在大鼠背部两侧压迫1 h,建立压力性损伤模型,造模后切除全部创面组织,分别进行苏木精-伊红、Masson、免疫荧光染色及Western blot检测。结果与结论:①细胞实验:活/死细胞染色结果显示,随着Yoda1浓度(0,2.5,5,10μmol/L)的升高,HaCaT细胞凋亡增加;随着Yoda1浓度(0,5,10μmol/L)的升高,HaCaT细胞钙离子内流增加,并且随着处理时间的延长,钙离子内流增多;Western blot检测结果显示,与对照组(0μmol/L Yoda1干预)比较,5,10μmol/L Yoda1干预可提升HaCaT细胞中BAX、TG2、PIEZO1蛋白的表达,降低Bcl-2蛋白的表达;②动物实验:苏木精-伊红与Masson染色结果显示,3个实验组压迫部位皮肤结构被破坏,皮下脂肪液化坏死,胶原蛋白稀疏且排列紊乱,并且随着磁铁厚度(压力)的增加,压迫部位皮肤组织结构破坏程度加重;免疫荧光染色与Western blot检测结果显示,与对照组比较,3个实验组大鼠BAX、TG2、Yap1与PIEZO1蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,并且随着磁铁厚度(压力)的增加,相关蛋白表达值改变更加明显;③结果表明:皮肤受压会激活PIEZO1使钙离子大量内流,随着所受压力的不断增加,最终导致钙超载后的细胞凋亡。

6-姜烯酚通过miRNA-26a-5p/DAPK1减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

为探究6-姜烯酚(6-Shogaol,6-SH)对大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)的保护作用,采用分子对接观察6-SH能否自发性结合microRNA-26a-5p(miRNA-26a-5P),双萤光素报告基因检测验证miRNA-26a-5p与死亡相关蛋白激酶1(ceath associated protein kinase 1,DAPK 1)的靶向关系;线栓法制备大鼠CIRI模型,雄性SD大鼠随机为假手术组、模型组、6-姜烯酚组;于CIRI后72 h进行改良神经功能评分,氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,评分后采集脑组织标本进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察神经细胞病理损伤情况,透射电镜观察神经元超微结构及自噬情况,免疫荧光检测自噬标志物,实时荧光定量和蛋白印迹法检测自噬和钙超载相关蛋白和基因。实验结果表明6姜烯酚可上调miRNA-26a-5p的表达,抑制DAPK1的表达,减轻大鼠CIRI后过度自噬和钙超载,发挥神经保护作用。

黄芪甲苷在N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的神经元兴奋性损伤中的保护作用

目的探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ)对N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)介导的神经元兴奋性损伤的保护作用。方法选择新生0~1 d的C57/BL6J小鼠,分离海马区神经元进行原代细胞培养,将培养的神经元随机分为对照组、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)损伤模型组、氧-糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型组、NMDAR抑制剂氯胺酮组及黄芪甲苷组。采用Hoechst-33342染色观察各组神经元死亡情况,采用ELISA法检测各组神经元乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况;采用Ca^(2+)成像观察不同条件下〔加入NMDA;NMDAR抑制剂APV(100μmol/L)预处理+NMDA;黄芪甲苷(100μmol/L)预处理+NMDA;无Ca^(2+)+NMDA〕神经元内钙离子浓度;采用Western blot测定各组神经元活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的表达。另选择出生后4~6周的C57BL/6雄性小鼠,制备包含海马的冠状脑切片,使用电压钳观察黄芪甲苷应用前后突触后膜电流的变化。结果与应用黄芪甲苷(100μmol/L)前比较,应用黄芪甲苷(100μmol/L)后海马CA1区锥体细胞微小兴奋性突触后电流的平均峰值降低〔(9.96±0.43)pA比(12.63±0.45)pA;t=3.741,P<0.05〕,平均频率〔(0.52±0.03)Hz比(0.68±0.05)Hz;t=2.933,P<0.05〕下降;与NMDA损伤模型组相比,黄芪甲苷组神经元凋亡率降低,LDH释放减少,活化型Caspase-3表达减低,细胞内钙离子内流减轻(均P<0.05);在体外OGD模型实验中,黄芪甲苷亦表现出同样的神经元保护作用。结论黄芪甲苷在NMDAR介导的神经元兴奋性损伤中具有保护作用,其作用机制与抑制NMDAR有关。

比索洛尔通过ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路改善缺血再灌注诱导的H9C2心肌细胞损伤的研究

目的:探讨比索洛尔对缺血再灌注(I/R)诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,将H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、缺氧/复氧(H/R)模型组(Model组)、比索洛尔组(Bisoprolol组)、比索洛尔+凋亡信号调节激酶1(ASK1)重组蛋白组(Bisoprolol+ASK1组)。除Control组外,其余各组H9C2心肌细胞均进行H/R损伤处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测细胞活力;采用流失细胞术检测细胞凋亡;采用酶联免疫吸附试验检测细胞中心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)]和炎症因子[白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;采用激光共聚焦检测细胞中钙离子浓度;采用蛋白质印迹法检测细胞中ASK1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,Model组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Bisoprolol组和Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均升高,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Bisoprolol组比较,Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:比索洛尔能够通过抑制炎症反应和钙超载,改善I/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其作用机制可能与抑制ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路激活有关。

线粒体钙单向转运体相关钙超载调控钙调蛋白对雨蛙肽诱导胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响

目的 通过体外细胞研究探讨线粒体钙单向转运体(MCU)相关钙超载通过调控钙调蛋白(CaM)对雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响。方法 使用10^(-7)mol/L雨蛙肽及10^(-5)mol/L MCU抑制剂钌红(RR)干预人胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)24 h,将细胞分为:Control组、雨蛙肽组、RR组、雨蛙肽+RR组。Western blot法检测细胞内MCU及CaM蛋白表达,荧光探针法检测细胞内游离Ca^(2+),免疫荧光双标法检测细胞内线粒体Ca^(2+),微丝染色法观察细胞微丝骨架结构。结果 雨蛙肽组与Control组比较,MCU及CaM蛋白表达、细胞质及线粒体内Ca^(2+)含量升高(P<0.05),细胞微丝骨架破坏;雨蛙肽+RR组与雨蛙肽组比较,MCU及CaM蛋白表达、胞质Ca^(2+)及线粒体内Ca^(2+)含量降低(P<0.05),细胞微丝骨架破坏减轻。结论 MCU相关钙超载可能通过激活CaM促进雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的破坏。

汉防己甲素通过抑制钙超载对小鼠重症急性胰腺炎的防治作用

目的:探讨汉防己甲素(Tet)在小鼠重症急性胰腺炎(SAP)体内和体外模型中的治疗作用及机制。方法:(1)提取C57BL/6小鼠胰腺,分离获得原代胰腺腺泡细胞(PACs),随机分为空白对照(Ctrl)组、Tet组、损伤[棕榈油酸(POA)或牛磺石胆酸钠(TLCS)]组和Tet治疗(Tet+POA或Tet+TLCS)组。Fluo-4荧光探针检测胞质钙浓度变化;碘化丙啶染色检测细胞坏死水平;TMRM荧光探针检测线粒体膜电位变化;DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)水平。(2)取健康8周龄C57BL/6雄性小鼠35只,随机分为Ctrl组、假手术组、Tet组、SAP模型[脂肪酸乙酯诱导的急性胰腺炎(FAEE-AP)或TLCS诱导的急性胰腺炎(TLCS-AP)]组和Tet治疗(Tet+FAEE-AP或Tet+TLCS-AP)组,每组5只。取各组模型胰腺组织,HE染色观察病理学改变;免疫组化法观察C/EBP同源蛋白(CHOP)的阳性表达;Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK和CHOP蛋白水平。采集血清,检测血清淀粉酶活性、白细胞介素6(IL-6)水平及氧化应激因子[丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]水平。取小鼠胰腺和肺组织,检测髓过氧化物酶(MPO)活性。结果:(1)在细胞实验中,Tet能够有效抑制POA或TLCS诱导PACs的钙超载和坏死,缓解PACs的线粒体膜电位降低,减少PACs内ROS生成(P<0.01)。(2)在动物实验中,与Ctrl组比较,SAP模型组小鼠胰腺组织病理学评分显著增高,血清淀粉酶活性、血清IL-6水平、胰腺MPO活性和肺MPO活性均显著升高(P<0.01);而Tet治疗能够有效减轻上述组织损伤和炎症反应(P<0.01)。与SAP模型组比较,Tet治疗能够降低内质网应激相关GRP78/PERK/CHOP信号通路的表达(P<0.01),减少血清过氧化物MDA,增加抗氧化物GSH-Px、SOD和CAT(P<0.01)。结论:Tet能通过抑制钙超载,缓解线粒体膜电位降低,减轻内质网应激反应和氧化应激损伤,从而减少PACs的坏死,发挥对小鼠SAP的防治作用。

基于钙超载探讨自主神经调控对HFpEF大鼠心肌结构重塑、电重塑及纤维化的影响

目的 探究自主神经调控对大鼠射血分数保留心力衰竭(HFpEF)模型结构重塑、电重塑及纤维化的影响。方法 SPF级12周龄SD大鼠44只,抽取10只作为对照组,余34只用于建立HFpEF模型。通过腹主动脉-下腔静脉瘘结扎的方式构建HFpEF模型。其中30只建模成功,4只死亡。建模成功的大鼠分为模型组、自主神经调控组(调控组)及自主神经调控+乙酰胆碱M2受体拮抗剂组(调控+拮抗组),每组10只。调控组在模型组基础上经皮耳缘迷走神经刺激。调控+拮抗组在调控组基础上每天经尾静脉注射美索曲明(0.5 mg/kg)。通过心脏超声仪测量心脏舒张末期左心室后壁厚度(LVPWD-D)、舒张末期室间隔厚度(IVS-D)及二尖瓣舒张早期/舒张晚期血流速度最大峰值(E/A)。心脏电生理刺激仪获取心脏的有效不应期(ERP)、单向动作电位时程(MAPD)。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测B型尿钠肽前体(NT-proBNP)水平。HE染色观察心肌细胞排列及炎性细胞浸润情况。Masson染色观察心肌纤维化程度。RT-PCR和Western blot检测心肌组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)及其调节蛋白受磷蛋白(PLB)mRNA及蛋白的表达。结果 HE染色可见模型组心肌细胞排列紊乱,细胞间隙不够明显,伴有炎性细胞浸润。Masson染色可见模型组心肌纤维排列紊乱,大量胶原纤维生成。调控组上述病理改变与模型组比较均明显减轻,而调控+拮抗组与模型组相比无明显改善。与对照组比较,模型组NT-proBNP、LVPWD-D、IVS-D、ERP、MAPD、MMP-9 mRNA及蛋白、PLB mRNA及蛋白表达均升高,E/A、TIMP-1 mRNA及蛋白、SERCA2a mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05)。与模型组比较,调控组NT-proBNP、LVPWD-D、IVS-D、ERP、MAPD、MMP-9 mRNA及蛋白、PLB mRNA及蛋白表达均降低,E/A、TIMP-1 mRNA及蛋白、SERCA2a mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05)。而调控+拮抗剂组上述指标与模型组比较差异无统计学意义。结论自主神经调控可能通过钙超载途径减轻HFpEF大鼠的结构重塑、电重塑以及心肌纤维化状态,改善HFpEF预后。

高压氧治疗急性缺血性脑卒中相关机制研究进展

缺血性脑卒中已成为首要死亡原因,且具有复发率、致死、致残率高,经济负担重等特点,目前再灌注是其核心治疗方法。但由于再灌注治疗具有严格的时间窗限制,临床实施较困难。研究表明缺血性脑卒中患者应用高压氧治疗具有一定的疗效,启动治疗的时间窗尚没有严格的限制,本文总结了高压氧治疗在抗炎症反应、抗自由基、抑制钙离子超载、抑制细胞凋亡、促进神经元的功能恢复、促进神经干细胞增殖等方面的最新研究进展。

声动力疗法的机制研究进展

声动力疗法是一种组织穿透性良好、精度高、副作用小的无创治疗手段。超声驱动的声动力治疗具有无创性、靶向性和组织穿透性等优势,且可显著增强肿瘤治疗效果,在肿瘤防治方面具有良好的应用前景。目前声动力疗法机制研究中尚缺乏超声机械力效应概述,本文就空化效应和机械力效应产生活性氧诱导钙超载途径进行综述。