大蒜类钙调蛋白基因AsCML15和AsCML42的分离及其在渗透胁迫中的功能分析

类钙调素蛋白(CMLs)是植物中的Ca 2+感受器之一,参与植物的生长发育和适应环境变化的过程。为了解大蒜CML的序列特征及其对渗透胁迫的响应,从大蒜品种苍山四六瓣中克隆得到AsCML15和AsCML42基因,并对其在干旱以及盐胁迫条件下的表达模式进行了分析。结果表明,AsCML15和AsCML42基因开放阅读框长度分别为498,543 bp,编码165,180个氨基酸残基。AsCML15和AsCML42分别含有4,3个EF-hand结构域。AsCML42与拟南芥AtCML42和AtCML43在进化关系上更为接近,而AsCML15与拟南芥AtCML15、AtCML16亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,AsCML15和AsCML42在鳞茎、叶片、根都有表达,且均能被200 mmol/L NaCl和15%PEG6000所诱导。AsCML15和AsCML42基因可能参与了大蒜抵御盐胁迫和干旱胁迫的过程,可进一步鉴定其生物学功能。

黄瓜类钙调蛋白CML8与性型分化主效基因编码蛋白的互作分析

【目的】为探索类钙调蛋白CMLs是否参与黄瓜性型分化过程,以便进一步完善性型分化调控网络提供参考。【方法】通过克隆黄瓜CML8、ACS1G、ACS2及ACS11基因,qPCR检测CML8基因在不同花型中的表达量,酵母双杂交检测CML8与黄瓜性型分化主效基因编码蛋白间的互作情况。【结果】克隆得到黄瓜CML8基因,完整ORF 441 bp,编码146 aa,不含信号肽;不含跨膜域,为胞外蛋白,含4个具有Ca^(2+)结合能力的EF-hand结构域,不含内含子,亚细胞定位在细胞膜和细胞质;克隆得到黄瓜性型分化关键基因F(ACS1G)、M(ACS2)及A(ACS11),序列比对表明三者的基因序列及编码蛋白序列与黄瓜数据库中的一致,且在雌花、雄花和两性花3种不同花型中的表达量差异显著,在雄花中差异极显著;酵母双杂交试验表明,CML8均可与ACS1G和ACS2发生互作,而不能与ACS11发生互作。【结论】成功克隆得到黄瓜CML8基因,且CML8可与ACS1G和ACS2发生互作,可能参与黄瓜性型分化过程,本研究首次探索类钙调蛋白参与植物性型分化过程,期望为钙信号系统参与植物性型分化提供参考。

类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析

【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的克隆与生物信息学分析

钙调蛋白(calmodulin,CaM)对生物体内多种Ca2+依赖的细胞功能和酶体系都有重要的调节作用。为研究扶桑绵粉蚧的信号转导受体蛋白,首次克隆了扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因PsCaM的cDNA全长序列,其开放阅读框(ORF)包含447bp的片段,编码148个氨基酸。PsCaM基因由3个内含子和4个外显子组成。3个内含子的长度分别为73、81、72bp,分隔的4个外显子的长度分别为33、133、183、98bp。功能域分析结果显示:该蛋白具有2个EF-hand结构域,有13个Ca2+结合位点;该蛋白的理论等电点是6.21,属于稳定蛋白,且没有跨膜区域;通过同源建模获得了其蛋白的三维结构。多序列比较显示,PsCaM基因相对较保守。

聚合酶链式反应扩增甘蔗钙调蛋白基因及其序列分析

从甘蔗茎顶端分生组织提取总RNA,反转录合成CDNA第一条链,以此为模板,参考大麦钙调蛋白基因序列设计并合成5′端和3′端引物,PCR扩增甘蔗钙调蛋白基因,与克隆载体PGEM—3Zf(十)重组,转化E.coli HB101得到重组克隆.DNA序列分析结果表明;甘蔗钙调蛋白基因由450个核甘酸组成,编码148个氨基酸;在核甘酸序列上与迄今知道的几种植物的钙调蛋白基因有很高的同源性,同源率在80%以上;编码的氨基酸序列同源性更高,同源率高达90%以上.

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因编码区cDNA长度为801bp，编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4．56，估计的相对分子质量为30．45ku。其对应基因组DNA序列长1983bp，包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBLl0蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBLIO基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBLl0与番茄S1CBLIO（NP_001239045）和拟南芥AtCBLl0（NP_195026）蛋白间的同源性较高，分别为82％和77％，并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达，50～200mmol·L^（-1）CaCl2、20μmol·L^（-1）ABA、100mmol·L^（-1）NaCl、10％（w／v）PEG6000或180mmol·L^（-1）甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBLIO基因具备植物CBL基因家族的固有特征，能够响应胞内钙浓度变化，对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。

钙对苹果果实钙调蛋白含量和Ca^(2＋)-ATPase活性及其基因表达的影响

研究不同浓度钙(0、1和10 mmo1/L CaCl2;5 mmo1/L EGTA)对苹果果实钙调蛋白(CaM)含量和Ca2+-AT-Pase活性及其基因表达的影响。利用同源克隆方法分离CaM和Ca2+-ATPase基因,采用荧光定量PCR方法研究它们表达特征。结果表明,果实切片外源补钙,可溶性Ca2+及CaM含量在高钙处理12 h达到高峰;高钙处理12 h质膜Ca2+-ATPase活性显著增加,与胞内CaM含量增加时间一致;高钙处理24 h液泡膜Ca2+-ATPase活性显著增加;随着质膜和液泡膜Ca2+-ATPase活性显著增加,可溶性Ca2+含量在加钙处理48 h显著下降。研究基因表达发现,加钙处理6 h苹果CaM基因的表达量显著增加;加钙处理12 h苹果Ca2+-ATPase基因的表达量显著增加,与CaM含量及质膜Ca2+-ATPase活性变化一致。果实缺钙处理显著增加CaM基因表达量,而苹果Ca2+-ATPase基因的表达量没有显著变化。上述研究表明,苹果补钙可以提高细胞内可溶性Ca2+和CaM含量以及CaM基因的表达量,有效启动钙信使系统;质膜及液泡膜Ca2+-ATPase是调控胞内Ca2+关键的酶,通过提高质膜及液泡膜Ca2+-ATPase的活性及Ca2+-ATPase基因的表达量,维持胞内Ca2+的稳态水平。

淫羊藿总黄酮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调蛋白基因表达的影响

目的从分子水平探讨肾阳虚证病理改变及淫羊藿总黄酮的作用及其机理,为开发药物的临床新用途提供理论依据。方法用大剂量外源糖皮质激素建立肾阳虚大鼠动物模型,以实时荧光定量RTPCR技术,测定各组大鼠下丘脑垂体肾上腺轴CaMmRNA的表达,以及淫羊藿总黄酮对其的影响。结果肾阳虚大鼠下丘脑、肾上腺CaMmRNA水平升高,垂体组织CaMmRNA水平没有显著变化,淫羊藿总黄酮能够降低下丘脑组织CaMmRNA水平,但对肾上腺影响不显著。结论大鼠肾阳虚证时下丘脑中CaMmRNA水平升高,淫羊藿总黄酮可使其降低。

豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆

目的克隆豚鼠钙调蛋白2(Ca M2)基因编码区及3′端非编码区,为豚鼠Ca M基因功能等研究提供遗传学信息。方法以豚鼠心肌组织作为实验材料提取RNA,通过RT-PCR和3′-RACE PCR的方法扩增Ca M2的编码区和3′端非编码区序列,应用基因工程技术插入克隆载体构建重组质粒后基因测序及分析。结果克隆出豚鼠Ca M2基因编码区450 bp序列和3′端非编码区660 bp序列。分析编码区序列所编码的氨基酸序列与其他种属其他亚型完全一致。而3′端非编码区与其他亚型的同源性较低。结论成功获得了豚鼠Ca M2基因编码区和3′端非编码区序列,为进一步研究Ca M2的基因功能及其在相关疾病中的作用奠定基础。

新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆盐生植物花花柴(Karelinia caspica)、盐爪爪(Kalidium foliadum)和盐桦(Betulahalophila)中分别克隆获得了450bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析的结果表明,所克隆的基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架。新疆花花柴钙调蛋白基因与盐爪爪钙调蛋白基因同源性达86%,盐爪爪与盐桦同源性达86.77%,花花柴与盐桦同源性达85.11%。新疆盐生植物钙调蛋白基因与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在80%以上,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性。

CYP3A5基因多态性与肾移植后钙调神经蛋白抑制剂慢性肾毒性的相关性

背景:钙调神经蛋白抑制剂是实体器官移植后抗排斥治疗中最重要的一线药物之一,主要通过包括CYP3A5在内的CYP3A亚家族进行代谢。但关于CYP3A5基因多态性与钙调神经蛋白抑制剂慢性肾毒性的相关研究国内外鲜有报道。目的:观察CYP3A5基因多态性与中国人群中钙调磷酸酶抑制剂慢性肾毒性发生的关系。方法:分别收集200例肾移植后出现慢性肾毒性的中国人种患者设为肾毒组;200例肾移植至少12个月后没有出现慢性肾毒性的中国人种患者设为对照组,取两组血样和临床数据。采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术分别检测两组的CYP3A5突变位点基因型。通过统计学分析CYP3A5的基因多态性与钙调神经蛋白抑制剂慢性肾毒性之间的关系。结果与结论:慢性肾毒组中CYP3A5基因型*1/*1+*1/*3(显示CYP3A5活性)和*3/*3(不显示CYP3A5活性)分别占39.5%(79/200)和60.5%(121/200);对照组中CYP3A5基因型*1/*1+*1/*3(显示CYP3A5活性)和*3/*3(不显示CYP3A5活性)分别占28.5%(57/200)和71.5%(143/200)。两组间差异有显著性意义(χ2=9.000,P<0.05,OR=1.638,95%CI=1.078-2.488)。通过Logistic回归分析CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3是显著的引起CNI慢性肾毒性的危险因素(P<0.05,OR=1.638,95%CI=1.078～2.488)。提示,CYP3A5的基因多态性可能增加肾移植患者慢性肾毒性的遗传易感性;参与钙调神经蛋白抑制剂慢性肾毒性疾病的发生。

扩增青霉钙调蛋白基因部分区域的引物设计

在本研究中,基于某些模型生物的钙调蛋白氨基酸序列及其基因序列,一套用于扩增其部分区域的PCR引物被设计出来。为了与传统分类方法相整合,基因组DNA的提取及扩增的方法均得到了改进和优化。用这套引物和方法,在青霉的钙调蛋白基因中从编码第9个氨基酸---谷氨酰胺(Gln)的密码子的第3个核苷酸到编码第122个氨基酸---缬氨酸(Val)的密码子的第3个核苷酸被成功扩增出来。这个区段包含了青霉钙调蛋白基因第2和第5外元(exon)的部分序列和全部三个内元 (intron) 序列约600bp左右,可直接进行双向直通测序,非常适用于青霉的种系学研究。

桑树2个钙调蛋白亚型基因cDNA克隆和序列分析

为了揭示钙调蛋白在桑树抗逆性方面的作用,利用SMART技术(switching mechanism at 5 end of RNA transcript)构建丰驰桑幼苗cDNA文库,从中获得2个钙调蛋白cDNA序列,2条序列的读码框均为450bp,均包括完整的3端非翻译区;序列比对分析发现,2条序列ORF(open reading frame)同源性为86%,但氨基酸同源性却为98%,说明是2个钙调蛋白基因,命名为MCaM-1,MCaM-2.其中MCaM-1与拟南芥CaM7、胡萝卜CaM4的氨基酸同源性达100%.这表明钙调蛋白序列在植物中相当保守.

豚鼠钙调蛋白1基因的克隆及序列分析

目的克隆豚鼠钙调蛋白1(CaM1)基因,对所克隆基因进行生物信息学分析。方法从豚鼠心室肌组织提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增CaM1基因编码区447bp的cDNA片段,插入克隆载体构建重组质粒后基因测序及序列分析。结果克隆出的基因片段编码CaM1全部149个氨基酸,核苷酸序列与多种哺乳动物相应基因的同源性大于90%。获得了该序列的限制性内切酶酶切位点等信息。结论成功获得了豚鼠CaM1基因编码区序列,为进一步重组表达CaM及其功能研究奠定基础。

肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-性腺轴钙调蛋白的基因表达及补肾中药的调整作用

目的从分子水平探讨肾阳虚证病理改变及补肾中药淫羊藿总黄酮作用机制,为肾阳虚证康复和开发药物的临床新用途提供理论依据。方法用大剂量外源糖皮质激素建立肾阳虚动物模型,以实时荧光定量RT-PCR技术,测定各组大鼠下丘脑-垂体-性腺轴钙调蛋白(CaM)mRNA的表达,以及淫羊藿总黄酮对其的影响。结果肾阳虚大鼠下丘脑、性腺CaMmRNA水平升高,垂体组织CaMmRNA水平没有显著变化,淫羊藿总黄酮能够降低下丘脑、睾丸组织CaMmRNA水平,但对垂体影响不显著。结论下丘脑中CaMmRNA水平升高与肾阳虚证有关,下丘脑、睾丸组织CaMmRNA水平的降低是淫羊藿总黄酮改善肾阳虚症状的作用机制之一。

桃钙调磷酸酶B类似蛋白基因家族鉴定与分析

为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族基因,分布于桃的5条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CBL蛋白均含有4个保守的EF结构域。进化树分析表明CBLs可分为4个亚家族。TMHMM 2.0Server分析显示仅PpCBL1含有1个跨膜区。PlantsPFeatureScan分析显示PpCBL2、3和5均含有1个N-豆蔻酰化位点。NetPhos 2.0 Server结果显示PpCBLs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CBL的功能提供重要的理论基础。

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。

生物信息学方法筛选华支睾吸虫成虫功能基因——钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白

目的本文通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因。方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对、序列拼接及基因完整性判断;并应用NCBI上的RPSBLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构。结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白(CsCBLP)基因,经同源性分析,CsCBLP与褐家鼠钙调神经磷酸酶(CaN)同源性为53%,与尾刺耐格里原虫CaNB同源性为40%,与新小杆线虫属结合蛋白的同源性为51%;保守域的比对及功能域、二级结构的预测显示所筛选的CsCBLP是钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物,属于钙结合蛋白家族。结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因。

钙调蛋白及其基因表达与先天性心脏病右心室舒张性心力衰竭发病关系的研究

目的：探讨先天性心脏病右心室舒张性心力衰竭（ＤＨＦ）患者心肌细胞内Ｃａ２＋超负荷、钙调蛋白及其基因表达的变化。 方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术测定１０例先天性心脏病右心室ＤＨＦ患者（ＤＨＦ组）和６例正常对照（对照组）钙调蛋白及其基因的表达。 结果：ＤＨＦ组患者心肌细胞内Ｃａ２＋含量较对照组高３倍以上，有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）；肌浆网钙－三磷酸腺苷酶（ＳＲ Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ）和细胞膜Ｌ型Ｃａ２＋通道的信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）水平较对照组减低，有显著性差异（Ｐ均＜０．０５），而肌浆网磷酸受纳蛋白、兰尼碱受体和肌集钙蛋白的ｍＲＮＡ表达较对照组无显著性差异；ＳＲ Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ蛋白的相对含量较对照组减低，有显著性差异（Ｐ＜０．０５＝；磷酸受纳蛋白的相对含量无显著性差异。 结论：细胞膜Ｌ型Ｃａ２＋通道和ＳＲ Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ基因表达减低是导致先天性心脏病心肌细胞内Ｃａ２＋超负荷和右心室ＤＨＦ发生的主导因素。

糖尿病大鼠心肌肌浆网钙调蛋白基因表达的改变

目的探讨糖尿病大鼠心肌细胞肌浆网钙调蛋白基因表达的改变。方法雄性SD大鼠经尾静脉注射四氧嘧啶(40mg/kg)复制糖尿病大鼠模型,对照组注射生理盐水,分别于4,6周处死,取心室肌组织,应用逆转录-聚合酶反应技术以肌动蛋白为内参照,测定肌浆网钙调蛋白钙泵(SERCA)、磷酸受纳蛋白(phospholamban)、ryanodine受体2型(RyR2)、1,4,5三磷酸肌醇受体2型(IP3R2)mRNA的变化。结果4,6周后糖尿病组大鼠的体重和心脏重量均低于正常对照组,但心脏/体重比显著大于正常对照组。4周糖尿病组大鼠心肌肌浆网SERCA、磷酸受纳蛋白、RyR2、IP3R2mRNA的表达与对照组相比无显著差异;6周的糖尿病组大鼠心肌肌浆网Ca2+-ATP酶的mRNA表达无明显变化,但磷酸受纳蛋白的mRNA表达显著高于而RyR2、IP3R2的mRNA表达显著低于对照组。结论糖尿病大鼠心肌细胞的肌浆网磷酸受纳蛋白的mRNA表达增加,RyR2、IP3R2的mRNA表达下降。