Calu-3细胞模型在吸入制剂研究中的应用

目的综述呼吸道上皮细胞模型calu-3的主要特点及其在吸入制剂研究中的应用。方法查阅文献,进行整理归纳。结果Calu-3细胞模型可用于药物经吸入途径给药的安全性和有效性评价、吸收促进剂筛选、药物吸收转运机制等方面的应用研究。结论Calu-3细胞模型在吸入制剂研究中具有广阔的应用前景。

Calu-3细胞内琥珀酸脱氢酶活性及表达的双重染色法研究

目的:利用Calu-3细胞探讨肿瘤细胞琥珀酸脱氢酶活性及表达双重染色技术。方法:体外培养Calu-3细胞,将细胞爬片分为三部分,第一部分采用氯化硝基四唑氮蓝法对细胞进行琥珀酸脱氢酶活性染色,并分别孵育40 min、1 h和2 h。第二部分进行该酶的免疫组织化学染色。第三部分进行琥珀酸脱氢酶的组织化学和免疫组织化学的双重染色。在光学显微镜下观察并比较琥珀酸脱氢酶活性及表达染色结果的差异。结果:(1)相比于孵育40 min和1h的细胞,孵育2 h的细胞则反应更加充分,蓝紫色双甲臜颗粒明显增多。(2)免疫组织化学染色的细胞内出现黄棕色DAB颗粒。(3)在活性和表达双重染色中,孵育1h时蓝紫色双甲臜颗粒和DAB黄棕色颗粒较其他孵育时间的更加明显。结论:在Calu-3细胞中,琥珀酸脱氢酶活性染色时孵育2h效果较好,而在活性和表达双重染色中,孵育1h时染色效果最好。

白头翁皂苷B4在Calu-3细胞单层中的渗透性研究

目的:建立白头翁皂苷B4的HPLC测定方法,研究其在单层Calu-3细胞中的渗透性。方法:色谱条件为Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm)、流动相为0.1%磷酸-乙腈(71%~29%)、流速为0.8 m L/min、检测波长205 nm、柱温25℃,考察不同浓度B4在Calu-3单层细胞中的渗透情况,以卡波姆974P为促渗剂,考察卡波姆对B4渗透性的影响。结果:B4在1.5~30.0 mg/L内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 3),B4在Calu-3细胞的渗透性具有浓度依赖性,卡波姆的加入提高了B4的渗透量。结论:B4的渗透以细胞旁路为主要途径,而卡波姆的加入可提高细胞旁路通透性,使药物渗透量增加。

Calu-3细胞气液界面培养及暴露研究的初探

目的探索Calu-3细胞气液界面(air-liquid interface,ALI)培养条件,及其在暴露系统中暴露洁净空气的耐受性。方法在Calu-3细胞3阶段培养:培养瓶扩增、液液培养至长满Transwell膜、ALI培养后,通过细胞跨上皮电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)的测定和紧密连接蛋白ZO-1的表达来确定细胞屏障状态;利用气液界面暴露系统将Calu-3细胞暴露在洁净空气中,暴露1、2、3、4、5、6 h,以培养箱培养的细胞作为对照,检测暴露后Calu-3细胞的活性、TEER的变化,确定基于ALI培养的Calu-3细胞在体外暴露系统中的单次最长暴露时间。结果Calu-3细胞液液培养(8±1)d长满Transwell膜,屏障形成,转为ALI培养,在ALI培养的1~18 d内屏障完整,状态稳定,可以用于暴露实验;Calu-3细胞的活性在洁净空气暴露6 h之后明显下降(P<0.01),TEER在洁净空气暴露4、5、6 h之后明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。结论ALI培养1~18 d的Calu-3细胞可以用于气液界面暴露实验;综合细胞活性和TEER的变化,Calu-3细胞在暴露系统中暴露洁净空气的单次最长暴露时间为3 h。

RNA干扰C-erbB-2对肺腺癌细胞calu-3增殖的影响

背景与目的:C-erbB-2基因在人乳腺癌、卵巢癌、肺癌中扩增及过量表达,与肿瘤恶性程度增高、转移能力增强、化疗抵抗密切相关,且与预后不良有关。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是一种新的基因治疗技术,能有效、特异性地抑制细胞内基因表达。本实验研究靶向C-erbB-2基因的siRNA(small interferingRNA)对C-erbB-2过表达的肺腺癌细胞calu-3增殖的影响。方法:化学合成的靶向C-erbB-2基因siRNA在脂质体的介导下转染calu-3细胞,观察转染前后细胞表型的改变;通过逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和流式细胞术检测转染前后细胞中C-erbB-2mRNA和蛋白水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法评价对calu-3细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况。结果:靶向C-erbB-2基因siRNA降低了calu-3细胞中C-erbB-2mRNA和蛋白的表达,转染C-erbB-2siRNA48h后calu-3细胞出现C-erbB-2蛋白表达下调。C-erbB-2蛋白阳性率为(25.04±1.56)%,与未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组比较[(98.24±2.23)%、(95.67±1.98)%和(94.79±0.87)%]有显著性差异(P<0.01)。同时C-erbB-2siRNA对calu细胞增殖有抑制作用,使细胞周期阻滞于G0/G1期[C-erbB-2siRNA组(56.6±3.6)%,未转染对照组(45.5±3.2)%,P<0.01],并能诱导细胞凋亡。结论:化学合成的靶向C-erbB-2基因siRNA能有效抑制C-erbB-2基因在calu-3细胞中的表达,并对calu-3细胞增殖有抑制作用。

高效液相色谱法测定苯环喹溴铵在Calu-3细胞中的摄取

目的建立苯环喹溴铵反相高效液相色谱法,研究其在Calu-3细胞上的摄取特征。方法色谱条件:Discovery C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水(0.27%磷酸二氢钾,0.3%三乙胺,稀磷酸调节pH至3.0)(35∶65),流速为1.0mL·min-1,检测波长210 nm,柱温25℃。考察了药物浓度、时间对BCQB在Calu-3细胞上摄取的影响。结果 BCQB在0.010 2～1.022 0μg·mL-1内呈良好的线性关系(r=0.999 8),最低定量限为0.010 2μg·mL-1。BCQB在Calu-3细胞中的摄取30 min达峰,后Calu-3细胞中BCQB的含量逐渐下降。浓度处于20～500μmol·L-1之间时,Calu-3细胞对BCQB的摄取量逐渐增加,浓度达到500μmol·L-1后,随着剂量的增加BCQB的摄取量变化不明显。结论该法快速、灵敏、简单。BCQB可被Calu-3细胞迅速摄取,随着剂量的增加,BCQB在Calu-3细胞中的摄取存在饱和现象。

CFTR对肺腺癌细胞Calu-3迁移影响的研究

采用常规培养肺腺癌细胞Calu-3的方法,利用MTT和CCK-8法确定囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)的激活剂(Genistein)和抑制剂(CFTRinh-172)的最适浓度,用CFTR激活剂和抑制剂的最佳浓度分别处理Calu-3细胞,然后采用划痕实验观测了培养48h后Calu-3细胞迁移的差异.结果表明:MTT法检测激活剂的最佳浓度为25μmol/L;CCK-8法检测抑制剂的最佳浓度为10μmol/L;划痕实验检测得出25μmol/L激活剂组细胞迁移数量((74.2±5.79)个)与对照组细胞迁移数量((134.1±10.04)个)相比具有显著性差异(P=0.00<0.01);10μmol/L抑制剂组细胞迁移数量((148.3±17.70)个)与对照组细胞迁移数量((134.1±10.04)个)相比无显著性差异(P=0.27>0.05).激活剂通过促进CFTR氯离子通道的开放,抑制了肺腺癌肿瘤细胞Calu-3的迁移.

芍药苷、薄荷脑对葛根素在Calu-3细胞模型转运过程中膜流动性、钠-钾离子ATP酶和钙离子ATP酶的影响

研究芍药苷、薄荷脑对葛根素在细胞模型转运过程中对Calu-3细胞膜生理功能的影响。以Calu-3细胞作为模拟鼻黏膜组织的体外细胞模型，采用荧光漂白恢复技术及超微量酶活性检测方法，考察细胞膜流动性、Na＋-K’-ATP酶和ca^2＋．ATP酶活性，探索配伍药物促进葛根素转运的作用机制。结果表明，配伍低、中、高浓度薄荷脑或同时配伍低、中、高浓度芍药苷和薄荷脑时，与单独使用葛根素相比，Calu-3细胞膜荧光漂白恢复率显著升高，Na^＋-K＋-ATP酶活性未发生明显改变，Ca^2＋-ATP酶活性显著增强，由此证实薄荷脑起到主要渗透促进作用，并且其作用机制可能与增加流动性、激活Ca^2＋-ATP酶活性密切相关。

吸入毒理云暴露系统的阳性验证体系的摸索

目的探索云暴露系统用于吸入毒理体外暴露实验的可行性。方法采用高、中、低(800、400、200 mg·L^(-1))3个浓度的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通过云暴露系统对气液界面(air-liquid interface,ALI)培养的Calu-3细胞进行暴露,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)暴露作阴性对照组,暴露1次,另取高浓度LPS溶液暴露5次,暴露结束后3 h和24 h分别检测Calu-3细胞的活性、乳酸脱氢酶(LDH)释放量、跨上皮电阻值(TEER)、黏蛋白MUC5AC以及炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α表达。结果与PBS阴性对照组相比,高、中、低3种浓度的LPS气液界面暴露于Calu-3细胞模型后,细胞的活性、LDH释放量无显著变化,但细胞电阻值降低,细胞的屏障功能受损;随着暴露浓度的升高,LPS促进细胞黏蛋白MUC5AC的表达,使细胞IL-6、IL-8表达下降,TNF-α表达上升;随着暴露频率的增加,LPS会抑制黏蛋白的表达,使IL-6表达上升;暴露频率增加的同时延长暴露后的检测时间会使细胞IL-8、TNF-α表达上升。结论ALI云暴露的方式可以有效反映细胞对阳性受试物的反应,此体外暴露方法可以用于后续暴露实验来评价化合物的吸入毒性。

外源微直流电场对肺腺癌细胞Calu-3迁移的影响

该文通过Time-lapse技术,以无电场作用的人肺腺癌细胞Calu-3细胞为对照组,以分别暴露于电场强度为2 V/cm、4 V/cm和6 V/cm的Calu-3细胞为实验组,研究了外源微直流电场对Calu-3迁移的影响。结果表明,Calu-3细胞可通过单细胞和群体细胞两种形式迁移,直流电场对这两种迁移形式具有显著的影响:无电场作用时,单细胞和群体性的Calu-3随机迁移;加入直流电场后,单细胞和群体性的Calu-3朝向负极定向迁移,迁移方向性指数、迁移方向持续性指数、轨迹速度、位移速度显著高于无电场作用的对照组。电场强度为4 V/cm时,单细胞和群体性的Calu-3趋电性最明显,迁移方向最恒定。相同强度的电场作用下,Calu-3群体细胞迁移的方向性指数和方向持续性均高于单细胞迁移,但单细胞迁移的轨迹速度和位移速度快于群体细胞迁移。

没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠Lewis肺癌增殖以及A549与Calu-3肺癌增殖的抑制作用

目的观察没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对小鼠Lewis肺癌增殖的抑制作用,并在细胞水平比较没食子儿茶素没食子酸酯对A549与Calu-3两种肺癌细胞增殖和凋亡的影响,初步分析可能的机制。方法利用C57BL/6J Lewis肺癌自发转移模型研究没食子儿茶素没食子酸酯(12.5、25、50 mg.kg-1口服给药,21 d)对Lewis肺癌增殖的抑制作用。采用WST-8方法检测5、10、50、100μmol.L-1的没食子儿茶素没食子酸酯对人源非小细胞肺癌Calu-3细胞及A549细胞增殖的抑制作用。利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒以及PI染色方法观察没食子儿茶素没食子酸酯对Calu-3细胞和A549细胞(Ki-Ras突变)的促凋亡作用。结果没食子儿茶素没食子酸酯剂量依赖性地抑制皮下移植Lewis肺癌的增殖;采用WST-8检测法观察到没食子儿茶素没食子酸酯对Calu-3细胞增殖呈剂量依赖性的抑制,而对A549细胞抑制作用较弱;TUNEL方法研究结果显示,没食子儿茶素没食子酸酯通过促凋亡作用抑制Calu-3细胞增殖;细胞计数结果表明,给予不同剂量的没食子儿茶素没食子酸酯之后,Calu-3细胞数呈剂量依赖性减少,A549细胞数目无显著性变化。结论没食子儿茶素没食子酸酯能够抑制Lewis肺癌增殖,并剂量依赖性的抑制Calu-3细胞的增殖,而对A549细胞增殖无明显抑制作用。

基于“鼻-脑”通路细胞模型组探索相对分子质量及粒径因素对药物制剂经鼻入脑的影响

目的基于"鼻-脑"通路体外细胞模型,探索药物制剂经鼻入脑的影响因素。方法将Calu-3细胞与嗅神经鞘细胞(OECs)细胞共培养,构建"鼻-脑"通路细胞模型组。以荧光素异硫氰酸酯右旋葡萄糖苷(FD)和荧光纳米银粒子(AgNPs)为模型药物,探索药物相对分子质量(Mw)因素及制剂粒径因素对药物经鼻入脑的影响。结果 FD随Mw增大其跨细胞单层膜转运表观渗透系数(Papp)减小;OECs对不同Mw FD的摄取在90 min后摄取量趋于饱和,随其Mw增大,相同摄取时间OECs摄取量有明显下降趋势。不同粒径荧光AgNPs在"鼻-脑"多通路细胞模型组Calu-3单层的Papp随纳米粒的粒径增大而减小,粒径<40 nm,其在Calu-3的转运特性表现为中等吸收(1×10-6<Papp<10×10-6),粒径>60 nm,其转运特性为难吸收(Papp<1×10-6);OECs对不同粒径荧光AgNPs的摄取在60min趋于饱和且随其粒径增大,相同摄取时间OECs摄取量有明显下降趋势。结论药物Mw大小及纳米制剂的粒径对于药物经鼻转运入脑具有重要影响,Mw<4 000的药物,粒径<40 nm的纳米粒子具有更好转运和摄取特性。

穿心莲内酯总磺化物在细胞模型上的转运研究

目的建立穿心莲内酯总磺化物反相高效液相色谱含量测定方法,研究其注射液中2种主要成分在calu-3和Caco-2细胞模型上的转运情况,评价将其应用于肺部给药和口服给药的安全性和有效性。方法细胞毒性实验筛选安全给药浓度。安全浓度以内的穿心莲内酯总磺化物注射液作用于Calu-3和Caco-2细胞模型,一定时间内取样,高效液相色谱法测定,考察浓度及时间对转运的影响,测定其主成分的表观渗透系数。结果药物浓度小于500μg·mL^(-1)时,Calu-3和Caco-2细胞存活率接近100%。建立的细胞模型显示出优良的紧密性和完整性。在Calu-3细胞模型上,17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠和17-氢-9-去氢穿心莲内酯双侧转运表观渗透系数均为1×10^(-5)数量级,在Caco-2细胞模型上,均为1×10^(-6)数量级。在2种细胞模型上,其外排比均小于2。结论穿心莲内酯总磺化物注射液主成分不是P糖蛋白的底物,在胃肠道中具有中等吸收,在呼吸道吸收良好,即肺部给药安全性和有效性更佳。