产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质

利用环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）快速筛选法从枝江酒业的酵泥中筛选获得11株CGTase产生菌。用酚酞法测定所得11株菌株的酶活,最终得到β-CGTase酶活最高的一株菌株,命名为Hhj-1。通过对菌株的形态观察以及16S rDNA测定,并建立该菌株的系统发育树,确定该菌株属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。对该菌所产的β-CGTase粗酶液酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH为7.5。在35~45℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上,且该酶在pH 5.0~10.0的较宽范围内都较稳定,说明其对pH适应范围较广,因此应用有较大的灵活性。

易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase),使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始β-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。

β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体p ET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 k Da左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质。结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适p H为7.0,并且在p H为5.5~10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5 h时仍保持90%以上的活性。研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca^(2+)对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用。对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/m L,Vmax为0.33 mg/(min·m L)。该研究成功实现了β-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础。

坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60℃,最适p H值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/m L,最大酶反应速率Vm=315.85μmol/(min·mg)。

首次从前列腺液中分离到坎皮纳斯类芽胞杆菌

目的对分离自慢性前列腺炎患者前列腺液中的一株棒状样细菌进行多相分类学研究,确定其系统发生位置及分类学特征。方法利用形态、生理和生化特性等表型性状初步鉴定细菌,通过基因测序及比对明确其种系来源。结果分离、培养出革兰阳性棒状样杆菌,可形成芽胞;生化反应不活泼;BLAST序列比对显示,该分离株与坎皮纳斯类芽胞杆菌(Paenibacillus campinasensis)菌株324T的16SrDNA序列相似度为99.4%,仅存在9个核苷酸差异。结论从表型性状和种系发生结果可证实该菌为坎皮纳斯类芽胞杆菌。鉴于其与模式株在生化特征方面存在显著差异,初步考虑该菌株是坎皮纳斯类芽胞杆菌的新亚型。