纳秒级陡脉冲电场诱导癌细胞凋亡的实验及作用机理研究

观察纳秒级陡脉冲电场诱导人浆液囊腺性卵巢癌SKOV3癌细胞凋亡效应,及其对细胞内钙离子浓度即[Ca2+]i的影响并探讨其作用机理。采用场强为10kV/cm、脉宽为100ns、重复频率为1Hz的纳秒级陡脉冲电场作用于SKOV3癌细胞悬液5min。4h后采用Annexin V-FITC/PI双标记并结合流式细胞仪分析SKOV3癌细胞的凋亡率,采用扫描和透射电子显微镜观察癌细胞凋亡的超微结构变化;以Fluo-3/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜检测纳秒级陡脉冲电场对SKOV3癌细胞[Ca2+]i的影响,及[Ca2+]i变化时的Ca2+来源。结果显示,流式细胞术检测到癌细胞的早期凋亡率为(22.21±2.71)%,明显高于对照组的(3.04±0.44)%(P<0.01),扫描和透射电子显微镜均观察到典型的凋亡细胞形态,证实纳秒级陡脉冲电场能够有效诱导SKOV3癌细胞发生凋亡;同时纳秒级陡脉冲电场可明显升高细胞[Ca2+]i(P<0.01),而与细胞外钙离子浓度无关(P>0.05)。由于纳秒级陡脉冲电场的等值频率很高,容易穿透细胞膜,其诱导凋亡的机制之一可能是通过激活细胞内钙库(内质网、线粒体),引起细胞内钙离子升高,从而介导凋亡信号通路。

陡脉冲电场对体外人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用

为研究陡脉冲电场的诱导凋亡作用,以体外人肝癌细胞SMMC-7721为实验对象,采用Annexin V-FITC/PI双染色并利用流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解片段化。实验发现,陡脉冲电场能有效(P<0.05)地使PS外翻,并且微秒级陡脉冲(μsSPEF)比纳秒级陡脉冲(nsSPEF)更有效(P<0.05);陡脉冲电场能使DNA降解片段化,且nsSPEF比μsSPEF更有效。实验结果表明,陡脉冲电场能有效诱导体外人肝癌细胞凋亡,其机理与陡脉冲电场非热效应及其频谱特性有关。μsSPEF主要作用于细胞膜,而可能通过外源性通路诱导细胞凋亡;nsSPEF主要作用于细胞核和线粒体等胞内细胞器,可能通过内源性通路诱导细胞凋亡。实验结果为陡脉冲电场杀伤肿瘤细胞的机制和参数选择提供了依据。

电脉冲化学治疗仪的研制

介绍一种高压电脉冲化学治疗仪的原理和结构。该仪器是通过高压脉冲电场对肿瘤细胞进行穿孔.在细胞膜上产生可恢复的微孔通道,使抗癌药物经该通道进入细胞内,达到治疗目的。该仪器由可编程脉冲发生器、高压可调稳压电源、高压功率开关和保护电路组成。

陡脉冲电场对肝癌细胞线粒体跨膜电位的影响

为研究陡脉冲电场的凋亡效应,以人肝癌细胞为实验对象,采用激光共聚焦扫描显微镜观察陡脉冲电场作用下细胞内线粒体跨膜电位的实时变化。实验结果表明,陡脉冲电场能使线粒体跨膜电位下降,较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度(600 V/100 ns)比较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度(200V/1.6μs)能使线粒体跨膜电位更快地下降,并且在停止施加陡脉冲电场后线粒体跨膜电位仍然在不断下降,进而有可能使线粒体跨膜电位崩溃,从而诱导肝癌细胞凋亡,为陡脉冲杀伤肿瘤细胞提供了理论依据。

陡脉冲电场对荷瘤BALB/c小鼠癌细胞杀伤效应的实验研究

观测陡脉冲电场对荷瘤BALB/c小鼠癌细胞的杀伤效应。处理后的癌细胞在光镜下表现为细胞核固缩、核碎裂、核溶解;在电镜下表现为异染色质增加,边集,呈团块样改变,细胞质肿胀,脂滴数量增加,质膜破裂;核固缩,碎裂,线粒体肿胀。实验揭示了陡脉冲电场能有效地杀伤癌细胞,明显抑制了荷瘤小鼠恶性肿瘤的生长、增殖,有着良好的应用前景。

陡脉冲电场对荷瘤BALB/C小鼠生存期的影响

观测陡脉冲对荷瘤 BAL B/ C小鼠癌细胞的杀伤效应和抑制作用。抑瘤观察中发现治疗组小鼠肿瘤体积明显减小 ,肿瘤生长受到抑制 ,治疗组和对照组间差异有显著性 ;生存期观察中发现经陡脉冲治疗后的荷瘤小鼠生存期明显延长。实验揭示了陡脉冲能有效地杀伤癌细胞 ,明显抑制了荷瘤小鼠恶性肿瘤的生长、增殖 。

陡脉冲电场对兔VX_2乳腺移植瘤毛细淋巴管的影响

背景与目的:以细胞膜电穿孔效应为核心的电化学治疗已开展二十余年,其主要机理为脉冲电场的膜穿孔促进外源药物、抗体或基因向胞内弥散。本课题组的前期研究已证实高能陡脉冲电场能使肿瘤细胞膜发生不可逆性电穿孔,从而导致肿瘤细胞的直接死亡。本实验主要观察陡脉冲电场对兔VX2乳腺移植瘤毛细淋巴管的影响。方法:成功建立VX2兔移植性乳腺瘤模型,采用美蓝灌注、酶组织化学5-核苷酸碱性磷酸酶(5′-AMP-ALPase)双重染色法、电镜技术观察陡脉冲处理后瘤体局部毛细淋巴管的形态学变化。结果:经美蓝灌注显示,陡脉冲处理后的癌组织边缘模糊,无线样或环状的淋巴管;双重染色显示,靶区内未见任何呈阳性染色的淋巴管,瘤体边缘仅见毛细淋巴管碎片样结构;透射电镜下见毛细淋巴管的完整性和连续性均被破坏。结论:陡脉冲电场破坏了靶区癌组织边缘的毛细淋巴管,因此可减少治疗后局部癌细胞淋巴转移的可能性。

R波同步电脉冲治疗癌症的实验研究

本文介绍一种采用与心电Ｒ波同步的电脉冲治疗癌症的新方法。采用该方法治疗后的肿瘤组织经病理切片观察表明在电极的阳极处癌细胞呈凝固性坏死，在阴极处呈液化性坏死，从而有效地破坏了肿瘤细胞，同时采用与Ｒ波同步方式触发治疗电脉冲能有效地解决直流电场对心脏自律性的影响，能减小肿癌组织对直流电场长期作用的适应性，提高了治疗肿瘤的效果。

癌和正常细胞熵产生的差异性及其治疗意义(英文)

通过热力学计算证明通常条件下癌细胞的熵产生率高于正常细胞,熵流方向为从癌到正常组织.但在适当外场作用下,正常细胞的熵产生率可提高更多,因而可以改变熵流方向,从而抑止癌的毒性信息流的扩散.设计了可试用于癌症治疗的方脉冲电场.

癌细胞和正常细胞熵产生的对比分析及在癌症治疗中的应用

依据非平衡热力学,对细胞内的熵产生率进行了计算,并对癌细胞和正常细胞的熵产生进行了对比分析,证明了在通常条件和无外场作用情况下,癌细胞的熵产生率高于正常细胞.但在电场和超声场作用下有可能使正常细胞获得较高的熵产生,因而发生熵流方向的倒转.考虑到信息量是熵在高维相空间中向低维子空间的投影,熵流方向倒转将避免癌细胞的有害信息向周围正常组织的扩散.提出利用方波脉冲电场和低频低强度超声场于癌症理疗的可能性.

微秒脉冲电场联合EPA对A-549细胞活性的影响

针对当前电化学疗法中使用的传统化疗药物对人体正常组织毒副作用较大,中药成分对人体毒副作用小但作用效果弱等问题,选用中药单体成分二十碳五烯酸(EPA)作为抗癌药物,探究微秒脉冲电场对EPA细胞毒性效果的促进作用,以及两者联合作用对肺癌A-549细胞的毒性效果。首先,研究不同场强的脉冲电场作用下细胞膜通透性变化情况,以及不同的药物浓度(50~1 000μmol/L)、电场强度(750~2 000 V/cm)对A-549细胞活性的影响,采用PI染色法检测细胞膜通透性、CCK-8法检测细胞活性;其次,根据检测结果筛选用于后续实验的电场强度区间为1 000~1 500 V/cm, EPA浓度为100~400μmol/L;最后,设置电场联合药物组为实验组,空白对照组、纯药物组、纯电组为对照组,进行了脉冲电场联合EPA对A-549细胞毒性效果的实验研究,并且对脉冲电场联合EPA共同作用后培养24 h(48 h)时A-549细胞活性的变化情况进行了对比分析。研究表明:微秒脉冲电场能够显著增强EPA对A-549细胞的毒性效果,并且EPA浓度为300μmol/L时,脉冲电场和EPA的联合作用效果最佳。微秒脉冲电场对EPA细胞毒性的增强效果可达40%以上,为后续中药成分干预癌症的治疗提供了重要的促进手段。

高压纳秒脉冲诱导宫颈癌细胞免疫原性死亡

目的研究高压纳秒脉冲电场(nanosecond pulse electric fields,nsPEFs)作用下是否诱导宫颈癌细胞发生免疫原性死亡(immunogenic cell death,ICD)。方法采用不同场强的nsPEFs处理人宫颈癌HeLa细胞和小鼠宫颈癌U14细胞,通过CCK-8法、流式细胞术和ELISA法分别检测电刺激后肿瘤细胞的细胞活性、凋亡率和免疫损伤相关分子(danger associated molecular patterns,DAMPs)的表达情况。结果随着场强的增加和处理后时间的延长,nsPEFs作用后细胞活力逐渐降低,凋亡率明显升高;在场强10 kV/cm以上的nsPEFs刺激后分别在24 h和3 h检测到HeLa和U14细胞的钙网蛋白(calreticulin,CRT)、热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)以及高迁移族蛋白(high mobility group box1,HMGB1)的表达上调。结论不同宫颈癌细胞在相同nsPEFs参数下的杀伤效果具有差异性;nsPEFs刺激后能诱导凋亡的宫颈癌细胞释放DAMPs从而可激活细胞发生免疫原性死亡。

脉冲磁场对人卵巢癌SKOV3细胞内Ca^(2+)和细胞膜电位的影响

目的研究脉冲磁场(8 Hz,200 m T)对卵巢癌细胞SKOV3细胞内Ca2+和细胞膜电位的影响及其作用机制。方法将SKOV3细胞分为对照组、脉冲磁场组、脉冲磁场+维拉帕米组。对照组不施加任何处理,其余2组给予脉冲磁场照射1 h,脉冲磁场+维拉帕米组同时加入维拉帕米50μmol/L。分别用荧光探针Fluo-3/AM及Di BAC4(3)及标记细胞内Ca2+和细胞膜电位,应用激光共聚焦显微镜检测磁场作用后细胞内平均荧光强度的变化,并采用流式细胞仪检测磁场作用后细胞凋亡情况。结果脉冲磁场诱导Fluo-3/AM荧光强度增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),维拉帕米干预后Ca2+荧光强度较脉冲磁场组明显减弱(P<0.05)。脉冲磁场诱导Di BAC4(3)荧光强度增加,细胞膜发生去极化,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);维拉帕米对脉冲磁场的去极化效应无明显影响(P>0.05)。脉冲磁场组凋亡率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论脉冲磁场作用于SKOV3细胞膜,使其发生去极化,从而激活电压依赖型钙离子通道,引起细胞内Ca2+浓度升高。而目前的脉冲磁场实验条件下,未促进细胞凋亡的发生。

低频脉冲电场逆转MCF-7/ADR对高三尖杉酯碱和长春新碱的耐药性

为了探讨低频脉冲电场对人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR耐药性的逆转作用及机制,采用MTT比色法检测MCF-7/ADR的耐药指数和耐药性的逆转倍数,荧光显微镜观察脉冲电场对MCF-7/ADR细胞内DiOC2(3)(P-gp的特异性荧光底物)积累和外排的影响。结果发现,在低频脉冲电场不影响MCF-7/ADR细胞生长的情况下,不同时间的电场作用均能逆转MCF-7/A的多药耐药,对高三尖杉酯碱(HHT)耐药性的逆转倍数在1.429～1.848之间,对长春新碱(VCR)耐药性的逆转倍数在1.473～2.090之间,45min电场作用的逆转效果最好,其次是30min电场作用。药物积累和外排实验结果表明,脉冲电场作用45min能使细胞内的DiOC2(3)积累明显增加,而30min电场作用能显著抑制DiOC2(3)的外排。促进药物积累和抑制其外排可能是脉冲电场逆转多药耐药的机制之一。

纳秒脉冲电场消融技术的生物机制及其在加速康复外科中的应用前景

为了发挥加速康复外科的优势,需要采用精准微创外科治疗手段,并与重要围手术期治疗方法切入整合。脉冲电场消融技术已在加速康复外科中显示出潜在优势,对于纳秒脉冲电场这一最新迭代技术的基础和临床研究也越来越多。本文着重系统回顾了纳秒脉冲电场在肝癌中的研究进展,揭示纳秒脉冲电场作用于细胞产生影响的机制,阐明这一微创技术在加速康复外科应用中的生物机制。纳秒脉冲具有诱导肝癌细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、激活免疫细胞、减少肿瘤复发与转移的作用。上述消融机制决定了纳秒脉冲电场消融肿瘤的临床应用场景。纳秒脉冲不产生焦耳热,可安全用于紧贴大血管的肿瘤;能突破手术和热消融禁区,微创精准用于大血管旁肿瘤的治疗;通过常温消融降低消融损伤、激活免疫。可以在门诊进行手术,缩短住院时间、降低卫生经济负担。

高压电场不可逆电穿孔抑制人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-氟尿嘧啶生长的作用

目的:观察不可逆电穿孔技术对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的人肝癌细胞(BEL-7402/5-Fu,购自南京凯基生物科技发展有限公司)生长、细胞膜完整性以及荷瘤鼠肿瘤生长的影响。方法:细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率。透射电镜、扫描电镜拍照以及乳酸脱氢酶(LDH)检测来评价细胞膜完整性。构建BEL-7402/5-Fu细胞裸鼠异种移植瘤模型来评价体内抗肿瘤效果。采用单因素方差分析。结果:高压电场显著抑制BEL-7402/5-Fu细胞生长并且呈场强依赖性,高压电场处理24 h后,500、750、1000、1500、2000 V/cm组的细胞存活率为(89.56±12.37)%、(66.29±7.47)%、(29.19±3.62)%、(17.66±1.64)%、(11.74±1.08)%(F=77.730,P<0.01)。扫描电镜以及透射电镜结果表明,在场强为1000 V/cm时,实验组的细胞膜完整性以及细胞器结构损伤严重。高压电场500、750、1000、1500、2000 V/cm各组的细胞培养基上清中LDH分泌水平分别为(35.33±8.74)、(64.33±7.67)、(144.02±12.16)、(194.33±5.13)、(207.33±11.01)、(213.33±20.81)U/L(F=122.690,P<0.01),呈场强依赖性。高压电场能够抑制BEL-7402/5-Fu荷瘤鼠肿瘤的生长,模型组的瘤重为(1.51±0.32)g,高压电场治疗组小鼠的瘤重为(0.28±0.05)g(F=619.870,P<0.01),抑瘤率达81.45%。结论:高压电脉冲能显著抑制BEL-7402/5-Fu细胞生长。

纳秒脉冲电场对人卵巢癌顺铂敏感及耐药细胞的凋亡诱导效应及机制研究

利用纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric fields,ns PEFs)治疗肿瘤具有潜在优势。该研究探讨了纳秒脉冲电场对体外培养的人卵巢癌顺铂敏感细胞COC1及顺铂耐药细胞COC1/DDP的生长抑制、凋亡诱导效应及其机制。CCK-8法分析显示,纳秒脉冲电场降低COC1及COC1/DDP细胞存活率,而且抑制效应呈明显时间依赖效应。流式细胞术检测结果结合Hoechst 33342荧光染色结果表明,纳秒脉冲电场可诱导COC1及COC1/DDP细胞发生凋亡。JC-1荧光染色及caspase-3蛋白酶活性检测表明,纳秒脉冲电场处理可引起COC1及COC1/DDP细胞线粒体膜电位降低及caspase-3活性增强。流式细胞术检测细胞周期显示,纳秒脉冲电场可将COC1细胞周期阻滞于S期。以上研究结果揭示,纳秒脉冲电场可以抑制COC1及COC1/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡,线粒体途径凋亡为其可能机制。

高压脉冲电场联合低温等离子体对小鼠肝癌细胞杀伤效果的研究

目的探究高压脉冲电场(PEF)联合低温等离子体(LTP)对小鼠肝癌细胞杀伤效果。方法小鼠肝癌细胞H22分为肝癌细胞组(无任何处理)、PEF处理组、LTP处理组、联合A组(先行PEF处理后立即行LTP处理)、联合B组(先行LTP处理后立即行PEF处理)、联合C组(同联合A组,但间隔20 min)、联合D组(同联合B组,但间隔20 min)。细胞计数试剂盒检测细胞存活率,流式细胞仪检测凋亡,荧光标记细胞内活性氧(ROS)并计数。20只4~6周龄健康雌性无特定病原体的昆明小鼠建立皮下移植瘤模型,随机分为模型组、PBS对照组、PEF实验组、LTP实验组及联合组(LTP+PEF,无间隔),每组4只。测量并计算肿瘤相对体积和抑瘤率。结果肝癌细胞组细胞存活率(98.3±0.9)%,PEF处理组(66.8±4.4)%,LTP处理组(62.1±3.9)%,联合A组(43.7±3.7)%,联合B组(31.0±1.4)%,联合C组(46.8±2.9)%,联合D组(39.0±2.3)%。与肝癌细胞组比较,各处理组细胞存活率均降低,且四个联合处理组细胞存活率低于PEF处理组和LTP处理组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中联合B组细胞存活率最低。凋亡检测结果与细胞存活率结果一致。荧光显微镜下,联合B组细胞ROS荧光明显增多,且LTP处理组细胞ROS荧光比PEF处理组多。联合B组的ROS阳性细胞百分比高于LTP处理组和PEF处理组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。联合组抑瘤率和肿瘤相对体积优于PEF实验组和LTP实验组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LTP联合PEF对小鼠肝癌细胞杀伤效果优于PEF和LTP单一处理,有望成为新的肿瘤治疗方法。

纳秒级陡脉冲电场对荷瘤小鼠乳腺癌的杀伤作用研究

目的以BALB／c荷瘤小鼠为对象，探讨纳秒级陡脉冲电场对在体小鼠乳腺癌的杀伤效应。方法取24只皮下接种小鼠乳腺癌细胞EMT-6的BALB／c荷瘤鼠，分为实验组和对照组，每组12只。在麻醉状态下，采用场强为700V／cm、脉宽为70μs、上升时间为57ns、占空比为50％的陡脉冲电场，利用自制的电极针插入实验组小鼠肿瘤两端进行电刺激处理，脉冲个数为100个，能量为9．75J，有效作用时间仅为7ms。对照组不进行电刺激，其他处理相同。隔天测量动物体质量、肿瘤大小，并在处理后第1、3、5、7天分别取肿瘤组织做病理切片。结果与对照组相比，实验组小鼠肿瘤生长速度较慢，特别在处理后1-3d内肿瘤几乎停止生长。组织病理结果显示电刺激处理后肿瘤组织有明显的凝固性坏死表现，组织水肿明显，处理后第3天肿瘤组织中出现大量空泡样结构，血管损伤在早期即出现。结论在给定电场条件下，陡脉冲电场对肿瘤生长有一定的抑制作用。要想达到更理想的肿瘤治疗效果，需对陡脉冲剂量进行进一步的研究。