旨在研究犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)作为溶瘤病毒的潜力并进一步探索精子黏附因子(SPAM1)协同CAV-2重塑肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的应用价值。本研究以P15A-CAV-2反向遗传操作平台为基础,使用RED/ET同源重组系统...旨在研究犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)作为溶瘤病毒的潜力并进一步探索精子黏附因子(SPAM1)协同CAV-2重塑肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的应用价值。本研究以P15A-CAV-2反向遗传操作平台为基础,使用RED/ET同源重组系统构建携带SPAM1外源基因的中间载体,使用中间载体将CAV-2骨架载体E3区域缺失并替换SPAM1外源基因表达盒。再利用合成引物敲除kmccdB反向筛选表达盒构建P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆质粒并在MDCK-E1A细胞系中拯救重组溶瘤病毒,对重组病毒体外溶瘤效应进行验证。根据测序与酶切验证结果证明,本研究成功构建并拯救出稳定表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒1株;IFA试验证明,重组毒株能够高水平稳定表达外源基因且外源蛋白具有可弥散分布于细胞间的特点。缺失E3区域表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒通过光镜观察和CCK8检测发现具有对犬癌细胞系A72强烈的杀伤效应。综上,本研究成功构建1株具有良好溶瘤效应的重组CAV-2,为后续应用于宠物肿瘤治疗奠定了基础。展开更多
文摘旨在研究犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)作为溶瘤病毒的潜力并进一步探索精子黏附因子(SPAM1)协同CAV-2重塑肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的应用价值。本研究以P15A-CAV-2反向遗传操作平台为基础,使用RED/ET同源重组系统构建携带SPAM1外源基因的中间载体,使用中间载体将CAV-2骨架载体E3区域缺失并替换SPAM1外源基因表达盒。再利用合成引物敲除kmccdB反向筛选表达盒构建P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆质粒并在MDCK-E1A细胞系中拯救重组溶瘤病毒,对重组病毒体外溶瘤效应进行验证。根据测序与酶切验证结果证明,本研究成功构建并拯救出稳定表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒1株;IFA试验证明,重组毒株能够高水平稳定表达外源基因且外源蛋白具有可弥散分布于细胞间的特点。缺失E3区域表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒通过光镜观察和CCK8检测发现具有对犬癌细胞系A72强烈的杀伤效应。综上,本研究成功构建1株具有良好溶瘤效应的重组CAV-2,为后续应用于宠物肿瘤治疗奠定了基础。
文摘为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。