Ⅱ型犬腺病毒C株E1、E3区克隆测序及E3区标记载体瞬时表达

设计4对引物,对犬Ⅱ型腺病毒2C(CAV-2C)株E1、E3区进行了扩增,将片段进行T克隆、测序,并构建了E3区缺失、标记EGFP的转移载体,在MDCK和293-T细胞上成功表达,但在MDCK细胞中的转染效率较低。本研究为犬腺病毒活病毒载体构建的研究提供基础。

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因,通过OverlapPCR融合为目的基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用,为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。

血管组织工程种子细胞的建立及意义

目的:利用人Nanog基因转染血管组织工程的种子细胞(血管内皮细胞ECV304),提高其增殖能力,以在较短时间内获得大量种子细胞,从而为克服血管组织工程种子细胞来源的匮乏及组织工程血管的快速构建提供新途径。方法:制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染ECV304细胞,然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的ECV304细胞中的表达,再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对血管内皮细胞ECV304生长的影响。结果:(1)rAAV2-hNanog转染ECV304细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在血管内皮细胞ECV304中稳定表达;同时,血管内皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强(P<0.05)。光镜下观察发现,转染的血管内皮细胞的形态无明显改变。结论:转染hNanog基因后,血管内皮细胞的形态无显著变化,但其增殖能力明显增强。利用hNanog基因提高血管内皮细胞的增殖能力,能够克服血管组织工程种子细胞来源不足的瓶颈,为组织工程血管的快速构建及应用提供一种新的方法。

从健康狐狸、貉粪中检出犬冠状病毒的两种基因型

取某养殖场健康狐狸 (6 1份 )、貉 (2 4份 )粪样 ,用套式PCR(RT-nPCR)方法检测犬冠状病毒 (CCV)并进行基因型鉴定。结果显示 :狐狸粪样中有 4 3份 (70 . 5 % )为CCVⅡ型阳性 ,2 9份 (47. 5 % )为CCVⅠ型阳性 ,两型混合感染2 5份 ,占 4 1 0 % ,两型总感染率为 77 .0 %。 2 4份貉粪样中 ,2 2份为CCVⅡ型阳性 (91 .7% ) ,其中 16份为CCVⅠ型、Ⅱ型混合感染 (6 6 . 7% )。分别取狐狸和貉粪样中CCVⅠ、Ⅱ型阳性PCR产物各 2份 (共 8份 )进行测序 ,均与CCV的M基因序列相符 ,证实PCR结果非假阳性。序列及系统进化分析表明 ,CCVⅠ型与源于意大利腹泻犬的CCVⅠ型 (AF5 0 2 5 83)同源性最高 (96 . 7%～ 98. 1% ) ;CCVⅠ、Ⅱ两种基因型同源性为 88. 3%～ 89. 7% ,在进化树中处于两个大的分支上 ;同为CCVⅡ型 ,狐狸源与貉源序列也存在多个位点差异。首次在貉粪中检出CCV ,证实在健康狐狸、貉群体中存在CCV流行 ,且CCVⅠ、Ⅱ型并存。

犬细小病毒、犬腺病毒Ⅰ型和犬腺病毒Ⅱ型三联PCR诊断方法的建立

旨在建立可同时检测犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒I型(canine adenovirus typeⅠ,CAV-Ⅰ)和犬腺病毒Ⅱ型(canine adenovirus typeⅡ,CAV-Ⅱ)的PCR诊断方法,分别将3种病毒基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5.0计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为670 bp(CPV)、497 bp(CAV-Ⅰ)和1019 bp(CAV-Ⅱ)。分别提取CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ细胞培养物的DNA,进行三联PCR扩增试验。结果表明,所建立的单项PCR及二联PCR扩增良好,其产物经测序比对与引物扩增序列完全一致。在此基础上,优化三联PCR扩增试验条件,成功建立了可同时检测CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的三联PCR诊断方法。并对其特异性和灵敏度进行检测,三联PCR最低检测限度为0.16 pg总DNA,而对犬副流感病毒和犬瘟热病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的20份病料进行检测,结果显示15份为CPV阳性,5份为CAV-Ⅰ阳性,1份为CAV-Ⅱ阳性。

用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便39份,用套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV).结果显示,南京家庭单养腹泻病犬CCV阳性率为40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高.健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%).取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本M基因212bp的序列与GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8～96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异.所有阳性样本用CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型.

γ干扰素转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用

目的 探讨小鼠γ干扰素 (mIFN γ)在肺内局部转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用。方法 6～ 8周龄雄性ICR小鼠 ,模型组第 0天经鼻滴入BLM 3mg/kg建立肺间质纤维化模型 ,预防治疗组于滴入BLM前 4 8h经鼻给予重组复制缺陷型mIFN γ腺病毒 (AdCMVmIFN γ) 5×10 8空斑形成单位 (pfu) /鼠 ,治疗组于滴入BLM后 72h经鼻给予等量AdCMVmIFN γ ,同时设立无外源活性基因的复制缺陷型腺病毒 (AdCMVNull)对照组和生理盐水阴性对照组。第 0、7、14天分别测小鼠体重 ,第 14天收获其支气管肺泡灌洗液 (BALF)和肺组织 ,右肺行苏木精 伊红 (HE)和Masson三色染色 ,左肺经酸解法检测肺组织羟脯氨酸 (HYP)含量。用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测BALF中mIFN γ的浓度。结果 AdCMVmIFN γ转基因预防治疗组和治疗组BALF中mIFN γ含量明显增高[(2 12 5 0± 6 4 97)pg/ml,(2 10 0 0± 5 4 5 1)pg/ml],其它组BALF中mIFN γ浓度为接近零水平。上述两组与其余各组比较 ,小鼠体重明显减轻 (P <0 .0 5 ) ,肺泡炎、纤维化程度均有加重倾向 (P =0 .0 7) ,肺HYP含量增高 (P <0 .0 5 )。结论 (1)AdCMVmIFN γ经鼻滴入可在小鼠肺内实现mIFN γ转基因表达 ;(2 )在BLM模型中 ,早期mIFN γ转基因表达可在某种程度上加重BLM诱导的肺?

生物人工肾小管上皮种子细胞的建立

目的利用人Nanog基因转染生物人工肾的种子细胞（肾近曲小管上皮细胞HKC），提高其增殖能力，在较短时间内获得大量种子细胞，为克服肾脏组织工程种子细胞来源的匮乏及生物人工肾的快速构建提供新途径。方法制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog，用rAAV2-hNanog转染肾小管上皮细胞，然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的肾小管上皮细胞中的表达，再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对肾小管细胞HKC生长的影响。结果rAAV2-hNanog转染肾小管上皮细胞后，RT-PCR检测表明hNanog基因能在肾小管上皮细胞中稳定表达；同时，小管上皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强（P〈0．05）。光镜下观察发现，转染的小管上皮细胞的形态无明显改变。结论利用hNanog基因提高生物人工肾小管种子细胞的增殖能力，可为生物人工肾的快速构建及应用提供一种新的方法。

成都地区犬腺病毒2型分子流行病学调查及其纤突基因的生物信息学分析

为了解成都地区犬腺病毒2型(canine Adenovirus tgpe 2,CAV-2)的流行情况及其纤突基因的遗传变异情况,试验对采集的291份样本(鼻腔样本78份、粪便样本213份)进行PCR检测,利用SPSS软件分析CAV-2感染与犬年龄、性别、免疫情况及季节之间的关系;对CAV-2阳性样本的纤突基因进行全基因扩增,并利用生物信息学软件对其遗传变异情况进行研究。结果表明:在291份样本中,CAV-2阳性率为16.49%(48/291),其中鼻腔样本中CAV-2检出率为17.95%(14/78),粪便样本中CAV-2检出率为15.96%(34/213)。6月龄以下的幼龄犬中CAV-2检出率较高,与其他年龄犬只间存在显著差异(P<0.05);免疫完全犬的感染率与未免疫和不完全免疫幼犬间存在极显著差异(P<0.01));CAV-2的感染率无性别、季节等差异(P>0.05)。获得的48条CAV-2纤突基因序列与`GenBank中收录的国内外CAV-2毒株之间有较高的核苷酸序列同源性(98.3%~99.9%)和氨基酸序列同源性(98.5%~99.6%);48例阳性样本的核苷酸序列都处于同一CAV-2分支上,CAV-2的纤突蛋白氨基酸序列的糖基化位点都发生在N-Linked糖基化的N-X-T、N-X-S这两种保守序列段中,糖基化位点的数目和位置未发生改变。说明CAV-2纤突基因的遗传性稳定,在成都地区未显示明显变异。