犬冠状病毒分子生物学研究进展

犬冠状病毒 ( CCV )基因组为一 2 8～3 2 kb大小的单股正链 RNA,基因在病毒自身RNA聚合酶的存在下、以先导引物转录机制进行转录 ,不同的病毒基因组和亚基因组翻译产生除病毒依赖 RNA的 RNA聚合酶以外 ,还产生其它病毒的结构蛋白和非结构蛋白 ,其中有相对比较保守、参与病毒核衣壳形成、介导宿主细胞免疫的核衣壳蛋白 ( N ) ;在病毒出芽、组装和成熟中起重要作用的膜蛋白 ( M) ;能刺激机体产生中和抗体 ,且易变异的纤突蛋白 ( S) ,另外 S蛋白还决定着病毒血清型、感染力 ,同时通过识别 ,并与病毒宿主细胞受体相互作用决定病毒感染的宿主范围 ;参与病毒组装的小膜蛋白 ( E)和其它病毒蛋白。 CCV还可识别猫氨肽酶 N( f APN)

犬冠状病毒YS1株人工感染犬试验

使用从腹泻犬体内分离获得的犬冠状病毒YS1第 5代CRFK细胞培养物 (毒价为 1 0 5TCID50 / 0 .1mL) ,以不同剂量人工感染 5 0只 2～ 3月龄健康幼犬 ,结果 1 4d内计有 1 6只犬发病 ,其中 1 4只耐过 ,2只死亡 ,发病率为 32 % ,死亡率为 1 2 .5 %。患犬粪便经电镜检查和RT -PCR检测 ,前者见有CCV样病毒 ,后者扩增出CCV特异核酸片段。 48只试验犬血清对该病毒的SN抗体效价随接毒量的不同分别平均为 1 :31 0、1 :2 45、1 :1 85、1 :1 1 5和 1 :86 ,约为相近量美国犬冠状病毒NL - 1 8株免疫犬的SN抗体效价的 2倍 ,表明YS1是一株免疫原性强的CCV强毒株。

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。

犬圆环病毒病研究进展

自2012年美国首次报道犬圆环病毒(CanineCV)以来,随后欧洲、北美洲及亚洲等地区陆续从腹泻犬中发现该病毒。犬圆环病毒可感染不同年龄段犬,尤其以幼龄犬感染率较高。该病毒可以感染狼和獾等食肉动物,经常与犬细小病毒发生混合感染,造成犬的出血性腹泻。犬圆环病毒(CanineCV)与其他肠道病毒协同作用,加重胃肠道疾病。然而对于犬圆环病毒病的研究还没有完全深入,论文就目前已知犬圆环病毒病的病原特征与致病性、流行病学、诊断等方面的研究进展进行概述,为犬圆环病毒的研究提供参考。

应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体

为了建立一种快速、敏感、特异的检测犬冠状病毒（ＣＣＶ）的方法，利用感染ＣＣＶ的犬肾传代细胞包被酶联反应板，以辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌Ａ蛋白（ＨＲＰ－ＳＰＡ）作为第２抗体，建立了检测ＣＣＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。抗原的包被量为每孔３×１０４个染毒细胞，酶标抗体的工作浓度为１∶４０。试验发现，包被的病毒抗原经甲醇固定３０ｍｉｎ后可以提高试验的敏感性，减少病毒抗原的使用量。与中和试验比较证实。

犬细小病毒病与冠状病毒病混合感染病例的诊治

犬细小病毒病与冠状病毒病是目前临床上常见的病毒性传染病，严重威胁犬的健康。本文通过犬细小病毒病与冠状病毒病典型病例的诊治，以便为犬两种传染病的诊治提供依据。

从健康狐狸、貉粪中检出犬冠状病毒的两种基因型

取某养殖场健康狐狸 (6 1份 )、貉 (2 4份 )粪样 ,用套式PCR(RT-nPCR)方法检测犬冠状病毒 (CCV)并进行基因型鉴定。结果显示 :狐狸粪样中有 4 3份 (70 . 5 % )为CCVⅡ型阳性 ,2 9份 (47. 5 % )为CCVⅠ型阳性 ,两型混合感染2 5份 ,占 4 1 0 % ,两型总感染率为 77 .0 %。 2 4份貉粪样中 ,2 2份为CCVⅡ型阳性 (91 .7% ) ,其中 16份为CCVⅠ型、Ⅱ型混合感染 (6 6 . 7% )。分别取狐狸和貉粪样中CCVⅠ、Ⅱ型阳性PCR产物各 2份 (共 8份 )进行测序 ,均与CCV的M基因序列相符 ,证实PCR结果非假阳性。序列及系统进化分析表明 ,CCVⅠ型与源于意大利腹泻犬的CCVⅠ型 (AF5 0 2 5 83)同源性最高 (96 . 7%～ 98. 1% ) ;CCVⅠ、Ⅱ两种基因型同源性为 88. 3%～ 89. 7% ,在进化树中处于两个大的分支上 ;同为CCVⅡ型 ,狐狸源与貉源序列也存在多个位点差异。首次在貉粪中检出CCV ,证实在健康狐狸、貉群体中存在CCV流行 ,且CCVⅠ、Ⅱ型并存。

犬圆环病毒荧光RAA检测方法的建立及初步应用

为建立一种高效、简便的犬圆环病毒(CCV)的检测方法,本研究针对CCV Rep基因设计了特异性引物和探针,同时构建了基于该病毒Rep基因的重组质粒标准品pCCV-Rep,经过优化后确定了CCV重组酶介导核酸等温扩增(RAA)检测方法引物、探针的最适浓度均为10μmol/L,在39℃恒温条件下20 min即可完成检测。利用该方法检测犬圆环病毒、狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒等其他常见的犬源病毒,结果显示除CCV外,该方法对其他病毒均无交叉反应,特异性较强;将p CCV-Rep分别稀释为10~6拷贝/μL~10~0拷贝/μL后作为模板,进行敏感性试验,结果显示该方法最低检出限可达10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内批间重复性试验结果均表明该方法具有良好的重复性。采用该方法与常规PCR方法同时检测82份犬粪便拭子,结果显示,该RAA方法检出阳性样品5份,检测结果与常规PCR一致。本实验首次建立的CCV荧光RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为CCV的临床筛查与流行病学研究提供了可行技术。

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列(登录号:KY063618.2),选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。

四川部分地区犬圆环病毒的病原检测及基因组特征

为调查犬圆环病毒(CanineCV)在四川部分地区的流行情况及基因组特征,本研究采用荧光定量PCR方法检测了2015年～2017年采集自四川6家宠物医院的208份腹泻犬粪便样品。结果显示CanineCV的平均阳性率为15.4%(32/208),3年间的检出率无明显变化;并且阳性样品均与一种或多种病原共感染。获得了6条完整的CanineCV Rep基因序列及1株CanineCV (CD17/2016)全基因组序列,进化分析显示CanineCV四川株(CD17/2016)与GenBank中的国内另外2株CanineCV遗传距离较远。本研究首次对国内腹泻犬进行了CanineCV感染的调查,证明CanineCV在四川部分地区宠物犬中已流行,建议把CanineCV作为犬腹泻病原诊断的一个检测内容,同时对其分子特征的研究结果将有助于进一步了解国内CanineCV的遗传多样性。

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2062 nt,与此前报道长度为2063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5′-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5′末端间隔区和3′末端间隔区长度分别为134(1929-2062 nt)和203 nt(913-1115 nt)。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株171的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析。结果表明,CCV171与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种。NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株。序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组“热点”区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似。CCVNJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV791683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组。CCVM蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内。M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守。N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关。

犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板,进行二联PCR扩增试验。结果表明,本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证,二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA,而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测,其中,4份为CBoV阳性,3份为CCV阳性,未检测到混合感染。综上所述,本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高,敏感性好,可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。

犬圆环病毒检测和致病性的研究进展

犬圆环病毒(Canine circovirus,Canine CV)是2012年首次在美国报道的一种新型哺乳动物圆环病毒。之后,意大利、德国和中国陆续报道检测到该病毒。目前已证实Canine CV可引起犬发生坏死性血管炎和淋巴结肉芽肿,临床表现为出血性腹泻和呕吐等,但该病毒的致病机理尚不清楚。文中主要对Canine CV的检测和致病性研究进展进行综述,为Canine CV的流行病学调查和致病机理研究等提供参考。

用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便39份,用套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV).结果显示,南京家庭单养腹泻病犬CCV阳性率为40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高.健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%).取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本M基因212bp的序列与GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8～96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异.所有阳性样本用CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型.

犬冠状病毒胶体金检测卡制备与评价

为快速检测犬冠状病毒,研究利用胶体金免疫层析技术制备和评价犬冠状病毒抗原检测卡。试验通过将胶体金标记的CCV Ab1和鼠IgG涂布于聚酯纤维膜上作为标记垫,生物素耦联的CCV Ab2处理在样品垫上,链霉亲和素和羊抗鼠IgG包被于NC膜上分别为检测线和质控线,与吸水纸和PVC底板制备犬冠状病毒抗原胶体金检测卡,并对其评价。结果:该检测卡不与其他病毒发生交叉反应,可检测浓度低至2 ng/mL的样本,24月是稳定的。结论:该测试板具有良好的特异性、灵敏度、重复性和稳定性,并且与RT-qPCR的结果较符合。因此,该检测卡能快速、准确地检测犬冠状病毒,为动物临床诊断和治疗提供参考。

两例犬细小病毒与犬冠状病毒的混合病例诊疗

应用犬细小病毒胶体金快速测试板和犬冠状病毒胶体金快速测试板检测2例收治于西宁市好伙伴宠物医院的雄性小泰迪犬病例,诊断为犬细小病毒和犬冠状病毒混合感染。采用注射犬单克隆抗体、犬免疫球蛋白、犬五连血清等特异性抗体疗法,结合抗感染、补液和对症治疗,取得了满意的治疗效果。

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。

犬圆环病毒ORF3基因的克隆及表达载体的构建

目的克隆犬圆环病毒(Canine circovirus,CanineCV)ORF3基因,制备ORF3的抗体,为研究ORF3的功能奠定基础。方法以CanineCV基因组为模板,PCR扩增编码框ORF3全长序列。将ORF3基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET(28a)-ORF3。重组质粒转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白ORF3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 PCR扩增出CanineCV编码框ORF3片段长度为318bp。构建的重组质粒pET(28a)-ORF3转化DE3后经IPTG诱导5h,表达分子质量单位(Mr)约为15×103蛋白,与预期相符。Western blot显示重组蛋白能被Anti-His标签抗体识别。结论成功构建了pET(28a)-ORF3重组原核表达质粒,并能在大肠杆菌中表达具有免疫反应性的ORF3,为抗ORF3抗体的制备奠定了基础。