CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用

为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。

RT-PCR检测CPIV方法的建立与应用

【目的】建立CPIV的RT-PCR检测方法。【方法】从临床上疑似犬副流感(CPI)的犬鼻腔分泌物中提取CPIV总RNA。根据Genebank中收录的CPIV(序列号AY581307)中NP基因保守序列,设计一对特异性引物,扩增出667 bp片段,以此建立CPIV的RT-PCR检测方法。【结果】特异性试验表明该引物不能扩增犬其它常见的传染病病毒基因。敏感性试验表明该引物能检测到10^(-6)的CPIV总RNA量。重复性试验表明该引物具有良好的稳定性和重复性。对临床采集的32份样品进行RT-PCR检测时,阳性率为53.12%。【结论】实验建立了CPI的RT-PCR检测方法,可适合于临床CPIV的早期快速诊断和小规模的分子流行病学调查。

核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立

根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。

虎血清中犬副流感病毒的抗体流行病学调查研究

为查明犬副流感病毒 (CPIV)对虎的感染情况 ,应用CPIV细胞培养物为血凝抑制 (HI)抗原 ,对上海、桂林、哈尔滨、宜昌、郑州等地区未曾使用过任何含CPIV疫苗免疫的 38只虎的血清进行HI抗体检测。结果表明 ,有 2 5份血清CPIV的HI抗体效价为 1∶4～ 1∶32 ,有 1 3份抗体效价 <1∶2 ,血清中CPIV的HI抗体阳性率达 65 79%。

犬副流感弱毒株的分离与鉴定

目的 分离并鉴定犬副流感弱毒株 ,供疫苗制备 .方法 根据犬副流感的血球吸附特性、细胞培养特性以及异种病毒抗血清阻断法分离病毒 (简称为 CPIV- XN4病毒 ) .并对其进行形态学、生物学特性等系统鉴定 .结果 病毒分离后其毒力可达 10 - 6 TCID5 0 .在电镜下可见较典型的犬副流感病毒形态结构特征 ;免疫电镜下见到抗体分子已被吸附在病毒颗粒表面 ;在几种细胞上盲传结果 MDCK和 Vero细胞出现程度不同的病变 (CPE) ;血清中和抗体效价 (SN)可达149.6 2 ;CPIV- XN4与国际标准毒株 D- 0 0 8之间有交叉中和反应 ;病毒接种到健康幼犬后 15 d内未发现仔犬死亡 ;攻毒实验结果 ,对照组有 2条在攻毒后 9d出现神经症状 ,第 14日衰竭而死 ,实验组动物均未出现临床症状 .结论 CPIV-

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F3B6、5B4C9、4G7F4和4C9D8。4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:105～1:106,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应。MAb4F3B6和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM。Western blot检测表明,4F3B6与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPIV的HN蛋白发生特异性反应,而5B4C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应。4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性。本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件。

1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72 h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534 bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80～200 nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12～48 h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIV N基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%～99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV5 1168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5 ZJQ 221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。

犬副流感病毒NP基因的克隆与原核表达

以犬副流感病毒RNA为模板,采用RT-PCR方法,连接pMD18-T载体获取NP蛋白编码基因核苷酸序列,并应用定向克隆技术,构建原核表达载体pGEX-6P-1-NP。经测序鉴定证实获取的NP蛋白核苷酸序列与GeneBank中标准序列存在两处碱基变异,导致编码的蛋白质出现一个氨基酸的变异。测序结果表明,克隆出的目的基因序列已定向克隆到pGEX-6P-1载体,成功构建了其原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达。Westen-Blotting分析结果显示,表达的GST-pGEX-6P-1-NP重组融合蛋白为82.1 kDa,可被犬副流感阳性血清所识别,表明NP基因所编码的蛋白具有一定的免疫活性。

犬副流感流行毒株的分离与鉴定

目的 分离和鉴定犬副流感病毒 .方法 无菌抽取病犬脑脊液 ,接种到 Vero细胞 ,72 h后收集培养液进行回归动物试验 ,并采用形态学观察、血凝特性、血球吸附试验以及细胞敏感性、中和试验和交叉中和试验等方法进行系统鉴定 .结果 从病犬脑脊液中分离出一株 CPIV流行毒株 (CPIV-XN931 ) .接种 Vero细胞后 ,出现明显的细胞病变作用 ,对Vero和 MDCK敏感 ,对 2 .5 m L· L- 1豚鼠红细胞具有显著的吸附作用 ;其超微结构具有副粘病毒的基本特点 ,中和抗体效价和交叉中和抗体效价都高达 10 2 4.结论 成功分离犬副流感病毒 CPIV-

犬副流感病毒CC-14株全基因组测序及分析

为研究犬副流感病毒（CPIV）CC-14株全基因组序列特征，本研究参照猴病毒5型全基因组序列设计了覆盖CPIVCC-14株基因组全长的14对引物，对CPIVCC-14株进行RT—PCR分段扩增，扩增产物分别克隆于pMD18-T载体中，以通用引物进行序列测定、拼接并分析。结果显示，CPIVCC-14株全基因组序列大小为15246nt（KP893891）。以高度保守的1530bpNP基因序列对现有的CPIV进行系统发生分析，同源比对结果显示，CPIV CC-14株与其他17株参考序列的核苷酸同源性为97．25％～99．80％，推导氨基酸同源性为98．62％～99．80％：系统发生分析显示，CC-14株与长春牛源PV5-BC14株同属一个分支。

犬副流感病毒HN基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

为建立检测犬副流感病毒(CPIV)抗体的方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达CPIV的HN蛋白,以其为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和血清最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立了CPIV血清抗体的间接ELISA检测方法。该方法仅与CPIV阳性血清发生特异性反应,与犬细小病毒(CPV)和犬腺病毒(CAV)的阳性血清无交叉反应;批内和批间变异系数小于10%。利用建立的ELISA方法与血凝抑制试验分别对48份送检犬血清样品进行检测,符合率为92%。本研究为建立快速、准确、简便的犬副流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。

犬瘟热与犬副流感病毒双重一步法RT-PCR检测方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感病毒(CPIV)的检测方法,依据GenBank中登录的CDV的H基因和CPIV的NP基因保守序列,设计合成扩增序列分别为593 bp (CDV H基因)、1 530 bp (CPIV NP基因)的2对引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测CDV和CPIV的双重一步法RT-PCR检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测CDV和CPIV,其最低检测限分别为3.58×10~6拷贝/μL和1.74×10~6拷贝/μL。对51份临床疑似病料样品进行检测,同时分别采用商品化的CDV和CPIV抗原检测试剂盒进行检测,结果二者符合率为100%。该结果表明本实验所建立的双重一步法RT-PCR方法的灵敏度及特异性均较好,可用于临床相关疫病的诊断。

犬副流感病毒分子克隆的构建及全基因组序列分析

为了解犬副流感病毒（CPIV）的基因组结构与遗传进化特征，应用RT—PCR分段扩增HRB—V毒株的5个片段，f1、f2、f3以及5′-末端和3′-末端，克隆到pHW2000栽体中并进行测序。经序列拼接获得全基因组序列，与OenBank登录的副流感病毒代表毒株进行对比分析。基因序列分析表明，HRB-V株基因组全长15246nt，含5′-末端、3′-末端和7个ORF具有副流感病毒基因组结构的典型特征；将结构蛋白F、HN以及全基因序列与参考毒株进行比较分析并做遗传进化树，结果表明，HRB—V与CPI一和CPI＋属同一分支，亲缘性相近。核苷酸以及氨基酸序列同源性分析结果表明，HRB-V与各病毒株的F基因的核苷酸同源性在96．5％～98．8％之间，氨基酸同源性为94．2％～98％；HN基因的核苷酸同源性在98．1％～99．5％之间，氨基酸同源性为97％～99．3％。以上试验证明副流感病毒人、猴、猪和犬sV5分离株基因差异较小，具有高度同源性。研究副流感病毒分子克隆的结构，为研究犬副流感病毒反向遗传操作技术平台奠定基础。

犬副流感病毒的分离鉴定及其F基因的遗传分析

14份疑似患副流感病毒病犬鼻咽拭子,处理后同步接种vero细胞,分离病毒。通过PCR检测、红细胞吸附试验和动物回归试验,确定1株为副流感病毒,命名为CPIV-CC。该株副流感病毒具有吸附豚鼠红细胞能力,能使vero细胞出现细胞病变。F基因与其他的犬副流感病毒F基因同源性高达97%以上。

犬副流感病毒D121004株的分离鉴定及其F基因遗传进化分析

为了给犬副流感病毒(CPIV)疫苗研制提供支持,无菌采集有呼吸道症状病死犬的脑和肺脏样品,处理后接种Marc-145细胞,通过RT-PCR、红细胞吸附试验,对盲传3代的细胞培养液进行鉴定,成功分离到1株CPIV。该病毒能使Marc-145细胞出现细胞病变,且具有吸附鸡红细胞的能力,将其命名为CPIV-D121004株。对该毒株的F糖蛋白全基因进行克隆及核苷酸同源性分析并构建遗传进化树,发现分离株的F基因较为保守,未出现大的遗传变异。今后需要对分离株的免疫原性进行研究,以探究其作为候选疫苗株的潜力。

2020—2022年华中地区犬副流感病毒检测及其F、HN基因系统发育分析

为探究华中地区犬副流感病毒(CPIV)的流行及遗传进化情况,利用RT-PCR方法对华中地区2020年9月—2022年1月收集的418份病料样品进行了CPIV检测,并利用生物信息学软件对分离的CPIV毒株的F、HN基因进行同源性、氨基酸位点分析及系统发育分析。结果显示:CPIV阳性率为15.8%,扩增获得9株CPIV的F、HN基因的序列,并成功分离培养9株CPIV毒株;同时,将分离株的F、HN基因与19株副流感病毒参考毒株进行序列比对分析,结果表明,F基因核苷酸同源性为95.1%~100%,氨基酸同源性为94.6%~99.8%,HN基因核苷酸同源性为95.9%~99.9%,氨基酸同源性为95.8%~99.6%;CPIV的F及HN基因与参考毒株相比均有部分氨基酸发生了突变;系统发育分析结果显示,本研究获得的8株分离株与美国株CPI-和CPI+处于同一分支上,亲缘关系较近,另一株分离株CS-324与中国株He N0718和韩国株D277位于同一分支上。本研究丰富了华中地区CPIV的流行病学调查资料,并为该病的综合防控提供了理论依据。

一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV51168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。

犬副流感病毒反转录-环介导等温扩增检测方法的建立

为了建立快速、敏感的犬副流感病毒（CPIV）核酸检测方法,针对CPIV的N基因的保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,进行CPIV的RT-LAMP反应。经优化反应条件,在链置换聚合酶的作用下,63℃扩增45 min获得结果,可通过核酸显色和琼脂糖凝胶电泳对结果进行判定。该方法具有较高的特异性和敏感性,可检测到1×10^1个拷贝数。CPIV的RT-LAMP方法方便于临床实践中犬副流感的快速检测与诊断。

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。