激活CB_(2)受体对MPP+诱导BV2小胶质细胞iNOS和Arg-1表达的影响

目的探讨激活大麻素Ⅱ型受体(CB_(2)受体)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的BV2小胶质细胞M1/M2表型转化的影响。方法培养BV2小胶质细胞,将其分为对照组、MPP+组、JWH133(CB_(2)受体激动剂)+MPP+组、AM630(CB_(2)受体抑制剂)+MPP+组、JWH133+AM630+MPP+组。应用免疫印迹法检测各组诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)蛋白的表达。结果与对照组相比,MPP+组BV2小胶质细胞iNOS蛋白表达明显上升(F=9.825,q=6.346,P<0.01);JWH133预处理抑制MPP+诱导的iNOS蛋白的上调(q=5.714,P<0.01),此抑制作用可被AM630逆转(q=4.154,P<0.05)。与MPP+组相比,JWH133预处理显著上调Arg-1蛋白表达水平(F=5.800,q=5.520,P<0.01),此作用可被AM630所阻断(q=4.155,P<0.05)。结论激活CB 2受体可抑制MPP+处理的BV2小胶质细胞M1极化,并且促进BV2小胶质细胞从M1型转化为M2型。

WIN55,212-2对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的：探讨大麻素（CB）受体激动剂WIN55，212-2对大鼠局灶性脑缺血的保护作用。方法：采用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）致局灶性脑缺血模型。将50只雄性SD大鼠随机分为5组：对照组（Con组）于MCAO前30min腹腔注射生理盐水0．3ml；WIN55，212-2组（WIN1～3组）于MCAO前30min腹腔注射WIN55，212-20．3，1和3mg／kg；DMSO组于MCAO前30min腹腔注射二甲基亚砜（DMSO）0．3ml。观察MCAO120 min再灌注24h后神经功能评分（NFS）和脑梗死容积百分比。结果：与DMSO组和Con组比较，WIN55，212-2组大鼠NFS明显升高（P〈0．05），脑梗死容积百分比明显减小（P〈0．05）。结论：CB受体激动剂WIN55，212-2对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用，并具有一定的剂量相关性。

大麻碱受体激动剂WIN55212-2与依西美坦协同抗肿瘤作用的发现

目的发现与大麻碱受体激动剂甲磺酸西地那非(WIN55212-2)具有协同抗肿瘤活性的药物,为提高肿瘤患者生活质量提供潜在的药物联合策略。方法采用肿瘤细胞增殖和活力检测的高通量测试方法,在3个大麻碱受体1(CB1R)高表达组织的肿瘤细胞系HepG2、DU145和HCT-8,筛查CB1R受体激动剂WIN55212-2分别与25种抗肿瘤药物联合使用时的抗肿瘤活性,对于初步显示有协同的药物联合再通过集落形成实验、3D肿瘤球增殖抑制试验进行确证。在此基础上,采用流式细胞仪检测协同有效的药物联合对细胞凋亡和周期分布的影响。结果发现3种药物在与WIN55212-2组合使用时显示有一定的协同抗肿瘤活性,其中依美西坦(exemestane)与WIN55212-2联合协同效果最佳,并在集落形成和3D肿瘤球增殖抑制试验中表现出浓度依赖性的协同抗肿瘤活性(联合指数CI<1)。与exemestane单用相比,exemestane与WIN55212-2联用显著增加HepG2细胞凋亡率(P<0.01),并引起HepG2细胞发生G2/M期阻滞。结论本研究首次发现将exemestane与WIN55212-2联用在HepG2细胞上具有协同抗肿瘤活性,这可能与其促进细胞凋亡和诱导细胞周期阻滞有关。

JWH133对MPP^+诱导的原代星形胶质细胞COX-2和iNOS表达的影响

目的探讨大麻素Ⅱ型受体(CB2受体)激活对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导原代星形胶质细胞炎症反应的影响。方法培养原代星形胶质细胞,生长状态良好时将其分为Control组、MPP+组、JWH133(CB2受体激动剂)+MPP+组、AM630(CB2受体抑制剂)+JWH133+MPP+组。应用免疫印迹法(Western Blot)检测Control组和MPP+组细胞CB2受体蛋白的表达。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组环氧化酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。结果与Control组相比,MPP+组的CB2受体蛋白表达上升(F=29.78,P<0.01)。与Control组比较,MPP+组COX-2和iNOS基因的表达明显上调(F=22.59、11.27,q=10.13、5.57,P<0.01);JWH133预处理抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS基因表达的上调(q=6.26、4.16,P<0.05);此抑制作用可被AM630所阻断(q=5.34、5.67,P<0.01)。结论激活CB2受体可抑制MPP+诱导的原代星形胶质细胞炎症反应。

大麻素受体2激动剂AM1241抑制大鼠脊髓损伤后纤维瘢痕形成

目的探讨AM1241对大鼠脊髓损伤后纤维瘢痕形成的作用及其机制。方法选取雌性6~8周龄Sprague-Dawley大鼠144只,分为4组:①假手术组(n=24)只移除椎板以暴露硬脊膜,不切开硬脊膜,术后给予生理盐水3 mL/kg;②载体组(n=40)建立大鼠脊髓背侧半切损伤模型,术后给予生理盐水3 mL/kg;③AM1241组(n=40)在载体组基础上给予大麻素受体2(cannabinoid receptor 2,CBR2)激动剂(AM1241,3 mg/kg)治疗;④AM1241+AM630组(n=40)在术后AM1241治疗前30 min给予CBR2拮抗剂(AM630,3 mg/kg)。各组药物均腹腔注射,1次/d,连续14 d。采用免疫荧光染色、Western blot、ELISA等方法评估AM1241对大鼠纤维瘢痕形成的抑制作用,同时采用行为学、电生理检测AM1241对大鼠神经功能的影响。结果与载体组比较,AM1241组大鼠脊髓损伤后,主要纤维瘢痕成分的表达降低,脊髓损伤后,纤维瘢痕面积减少,给予CBR2拮抗剂AM630后逆转了上述现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。tubulinβⅢ免疫荧光染色、行为学评估、电生理实验结果显示:AM1241组促进了脊髓神经元细胞的存活,改善了脊髓损伤后的神经功能,包括Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[载体组(15.38±0.38)vs AM1241组(18.38±0.50)vs AM1241+AM630组(15.50±0.33),P<0.05]、斜板实验角度[载体组(54.25±1.25)°vs AM1241组(64.25±1.05)°vs AM1241+AM630组(54.75±0.49)°,P<0.05]等;ELISA实验结果显示:AM1241组抑制M1型巨噬细胞标记物iNOS、TNF-α、IL-1β的表达(P<0.05),增强M2型巨噬细胞标记物CD206、Arg-1的表达(P<0.05),降低促纤维化因子TGF-β1的表达(P<0.01);而应用CBR2拮抗剂AM630后逆转了上述作用。结论刺激大鼠CBR2能减少脊髓损伤后纤维瘢痕、改善神经功能,这一作用可能是通过影响巨噬细胞极化来实现的。

覆盆子化学成分的分离鉴定及其新型大麻素2型受体激动剂的筛选和抗骨质疏松作用评价

目的 以大麻素2型受体(cannabinoid receptor type 2,CB2R)为靶点,从补肾中药覆盆子中分离、鉴定、筛选得到具有激动CB2R的激动剂,并探讨其抗骨质疏松作用的机制。方法 以激动CB2R活性为导向进行分离并筛选,采用正相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、大孔树脂、重结晶和半制备型高效液相色谱对二氯甲烷层和醋酸乙酯层浸膏进行分离,结合化合物理化性质和核磁共振波谱对分离得到的化合物进行结构鉴定。通过双荧光素酶方法筛选出具有可特异性激动CB2R的化合物,并通过测定转染CB2R的人胚胎肾细胞HEK293-CB2内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)积聚水平和CB2R蛋白表达情况来验证筛选的化合物对CB2R的特异性激动活性,最后评价筛选得到的化合物对破骨细胞骨代谢方面的调节作用。结果 以激动CB2R为活性导向进行分离和筛选,共得到24个化合物,分别鉴定为山柰酚(1)、木犀草苷(2)、银椴苷(3)、金丝桃苷(4)、橙皮素(5)、刺芒柄花素(6)、槲皮素(7)、对羟基苯甲酸(8)、迷迭香酸(9)、对羟基苯甲酸乙酯(10)、水杨酸(11)、没食子酸(12)、咖啡酸(13)、原儿茶酸(14)、鞣花酸(15)、香草酸(16)、loliolide(17)、对羟基苯甲酸甲酯(18)、ethyl dioxindole-3-acetate(19)、苦莓苷F1(20)、科罗索酸(21)、委陵菜酸(22)、山楂酸(23)、野鸦椿酸(24)。双荧光素酶筛选体系从24个化合物中筛选得到2个新的CB2R激动剂(化合物5和8)。c AMP和蛋白免疫印迹表明筛选得到化合物5和8对CB2R具有特异性激动活性和较好的亲和力,可显著抑制破骨细胞的活性并影响其骨吸收功能。结论 化合物2、5、6、9、13、14、17、19为首次从中药覆盆子中分离得到。2个新的CB2R激动剂(化合物5和8)能特异性地激动CB2R并增加CB2R蛋白的表达,抑制给药刺激后HEK293-CB2细胞内c AMP的积累;以CB2R依赖性对破骨细胞功能的正常发挥产生影响。

大麻素2型受体激动剂JWH133调节小鼠胰腺腺泡细胞钙信号及治疗急性胰腺炎的机制

目的观察JWH133对乙酰胆碱(ACh)引起的Ca^2+振荡的影响,探讨其作用机制及靶点。方法酶解法分离小鼠胰腺腺泡细胞,利用膜片钳全细胞记录,通过细胞外给药方式,在分离的胰腺腺泡细胞上观察10μmol/L JWH133对10 nmol/L ACh引起Ca^2+振荡的影响,检测JWH133的药理学作用。记录10μmol/L JWH133对10 mmol/L左旋精氨酸(L-Arg)引起的Ca^2+振荡增强作用的影响。通过L-Arg诱发小鼠急性胰腺炎模型,观察并测量胰腺组织结构,细胞形态及出血坏死情况。结果JWH133作用的靶点为细胞表面的大麻素2型受体(CB2R)。10μmol/L的JWH133能将10 nmol/L ACh引起Ca^2+振荡的标准化净电流减少到(26.0±4.2)%(P<0.01,n=9)。在CB2R敲除(CB2R-KO)小鼠,与给药前比较,施加10μmol/L的JWH133后,ACh引起Ca^2+振荡的净电流(标准化后)为(97.0±6.7)%(P>0.05,n=9)。应用10μmol/L的JWH133则可将10 mmol/L L-Arg引起增强的Ca^2+振荡的标准化静电流减少至(106.0±16.7)%(P<0.01,n=10)。此外,病理切片显示JWH133预处理的胰腺组织在水肿、炎症和坏死水平均有所改善,病理学评分差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论JWH133是通过特异性抑制细胞外的CB2R来抑制细胞内Ca2+信号。JWH133对L-Arg诱发的小鼠急性胰腺炎模型的病理有改善作用。

熟地黄的大麻素2型受体激动剂活性及对骨代谢的调控作用研究

目的 探究熟地黄的大麻素2型受体(cannabinoid receptor 2,CB2R)激动活性及其对骨代谢的调控作用。方法采用双荧光素酶报告基因建立CB2R调节剂筛选体系;分别给予熟地黄提取物或CB2R选择性激动剂HU308或CB2R反向激动剂AM630处理,采用CCK-8法测定成骨细胞和破骨细胞的增殖活性;采用磷酸苯二钠法测定成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)的活性;采用流式细胞仪测定成骨细胞的细胞周期;采用ALP染色观察成骨细胞分化;采用茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成;采用TRAP染色观察破骨细胞数目;采用罗丹明-鬼笔环肽染色镜观察破骨细胞F-肌动蛋白(F-actin)环的结构和形态;采用Western blotting检测CB2R及骨代谢相关蛋白的表达。结果 500μg/mL熟地黄显著升高HEK293-CB2R细胞CB2R表达(P<0.001),抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R细胞中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的产生,并且其对CB2R的激动活性可被AM630逆转(P<0.001)。500μg/mL熟地黄显著促进成骨细胞增殖(P<0.001),升高ALP活性(P<0.001),促进骨矿化结节形成,上调CB2R及骨形成相关蛋白的表达(P<0.05、0.01、0.001),抑制p38的表达(P<0.05);抑制破骨细胞形成分化,降低TRAP活性(P<0.001),抑制F-actin环的形成,下调CB2R、p-p38和骨吸收相关蛋白的表达(P<0.05、0.001);熟地黄对成骨细胞和破骨细胞的作用可被AM630逆转(P<0.05、0.01、0.001)。结论 熟地黄具有特异性的CB2R激动活性,并可通过CB2R调控成骨细胞和破骨细胞的功能。