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Expression of the Capsid Precursor Protein gene of Foot-and-mouth Disease Virus and Green Fluorescent Protein Gene in BHK-21 Cells Mediated by Retroviral Vector
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作者 LI Jiong LIU Yan-hong +4 位作者 AN Fang-lan LIU Jun-lin LIU Xiang-tao SHANG You-jun YIN Hong 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第S1期70-75,共6页
We have constructed a retroviral vector mediated mammalian cell expression system of the capsid precursor protein of foot-and-mouth disease virus(FMDV).The recombinant retroviral vector pBABEpuro-P1-2A-EGFP was constr... We have constructed a retroviral vector mediated mammalian cell expression system of the capsid precursor protein of foot-and-mouth disease virus(FMDV).The recombinant retroviral vector pBABEpuro-P1-2A-EGFP was constructed by sequentially inserting capsid precursor protein gene(P1) of FMDV and enhanced green fluorescent protein gene(EGFP) into pBABEpuro.The recombinant retroviral vector and the pVSV-G plasmid were co-transfected into packaging cells(GP2-293) by liposomemediated transduction to produce the pseudovirus.The pseudovirus was used to infect BHK-21 cells and resistant cells were screened with puromycin.Green fluorescent proteins were observed by fluorescence microscopy and expression of the capsid precursor protein gene of FMDV was detected by indirect immunofluorescence.The recombinant retroviral vector pBABEpuro-P1-2A-EGFP was constructed successfully.The capsid precursor protein of FMDV and green fluorescent protein were expressed in BHK-21 cells.The mammalian cell expression system for the capsid precursor protein of FMDV has been constructed successfully,which lays the foundation of development of a FMDV subunit vaccine. 展开更多
关键词 retroviral vector FMDV capsid precursor protein gene green fluorescent protein gene BHK-21 cell
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Expression and Immunological Analysis of Capsid Protein Precursor of Swine Vesicular Disease Virus HK/70 被引量:3
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作者 Hong TIAN Jing-yan WU You-jun SHANG Shuang-hui YING Hai-xue ZHENG Xiang-tao LIU 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2010年第3期206-212,共7页
VP1, a capsid protein of swine vesicular disease virus, was cloned from the SVDV HK/70 strain and inserted into retroviral vector pBABE puro, and expressed in PK15 cells by an retroviral expression system. The ability... VP1, a capsid protein of swine vesicular disease virus, was cloned from the SVDV HK/70 strain and inserted into retroviral vector pBABE puro, and expressed in PK15 cells by an retroviral expression system. The ability of the VP1 protein to induce an immune response was then evaluated in guinea pigs. Western blot and ELISA results indicated that the VP1 protein can be recognized by SVDV positive serum, Furthermore, anti-SVDV specific antibodies and lymphocyte proliferation were elicited and increased by VP1 protein after vaccination. These results encourage further work towards the development of a vaccine against SVDV infection. 展开更多
关键词 Swine vesicular disease virus capsid protein precursor gene (vp1) gene expression Immunere sponse
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Eukaryotic Expression and Activity Analysis of Capsid Gene of Swine Vesicular Disease Virus HK/70
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作者 TIAN Hong WU Jingyan SHANG Youjun YING Shuanghui ZHENG Haixue LIU Xiangtao XIE Qingge 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2009年第4期25-30,共6页
The capsid protein precursor (P1), which plays a major role for the generation of polypeptides of swine vesicular disease virus (SVDV), was cloned from SVDV HK/70 strain into the retroviral vector pBABE puro and e... The capsid protein precursor (P1), which plays a major role for the generation of polypeptides of swine vesicular disease virus (SVDV), was cloned from SVDV HK/70 strain into the retroviral vector pBABE puro and expressed in the mammalian cell line PK15 through the retroviral expression system. The activity of recombinant protein to induce immune response was evaluated in guinea pigs. IFA and Western Blot were used to detect the recombinant protein expression. The results showed that the recombinant protein could be recognized by SVDV positive serum, and animal test showed SVDV-specific antibodies. All of those results indicate that a retroviral-based vaccine carrying the capsid protein precursor (P1) of SVD is able to be expressed in the eukaryotic cell and elicites strong SVDV-specific immune responses in guinea pigs. 展开更多
关键词 swine vesicular disease virus capsid protein precursor gene gene expression immune response
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Cloning and Expression of the vp39 Gene of Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus in E.coli 被引量:1
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作者 Liu Dell, Sun Xiaojie, Qi Yipeng, Zhu Ying, Jin Tianquan(Institute of Virology, Wuhan University,Wuhan 430072, China) 《Wuhan University Journal of Natural Sciences》 EI CAS 1998年第1期108-112,共5页
The nuclear capsid protein gene (vp39) ofBombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) was amplified successfully by PCR technique and inserted into pGEM 3zf(+). The 5′ and 3′ terminal area of the amplified vp39 ge... The nuclear capsid protein gene (vp39) ofBombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) was amplified successfully by PCR technique and inserted into pGEM 3zf(+). The 5′ and 3′ terminal area of the amplified vp39 gene were sequenced with silver-staining dideoxy method. Bmvp39 gene was sub-cloned into the expression vector pRSET-A, and transformed intoE. coli BL21. This gene was highly expressed by IPTG induction. SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein is about 38 kd, and the expressed amount reached maxium in 4 h with IPTG induction. 展开更多
关键词 nuclear capsid protein gene (vp39) PCR amplification gene cloning expression BMNPV
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肠道病毒ECHO_(13)中国分离株的基因特征 被引量:27
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作者 毛乃颖 许文波 +4 位作者 杨秀惠 刘中华 严延生 潘伟毅 张勇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期308-314,共7页
为研究ECHO13病毒中国分离株的分子特征及其与世界其它分离株之间的基因关系,对1998年、2000年从中国福建省分离到2株ECHO13病毒进行基因序列对比分析。2株病毒分别命名为Fujian98-1和Fujian00-1,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP... 为研究ECHO13病毒中国分离株的分子特征及其与世界其它分离株之间的基因关系,对1998年、2000年从中国福建省分离到2株ECHO13病毒进行基因序列对比分析。2株病毒分别命名为Fujian98-1和Fujian00-1,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因全长861个核苷酸片段并进行序列测定,将2株E CHO13病毒的VP1序列与所有已发表的ECHO13病毒VP1基因全长进行同源性比较。结果显示,福建分离株之间核苷酸同源性为79 6%,氨基酸同源性为93 4%;与遗传距离最近的法国CF1089-91(AJ537604)毒株的核苷酸同源性分别为80%和88%,与代表株DelCarmen的核苷酸同源性分别为75 8%和77 9%。通过VP1基因分析,福建2株病毒均属于ECHO13病毒,与血清中和试验鉴定结果一致。下载所有已发表的ECHO13病毒VP1序列并构建进化树,发现福建2株病毒分属不同的分枝,提示这2株病毒来自不同的病毒传播链。进一步分析发现,整个E CHO13病毒可划分为3个不同的基因型:A、B和C基因型。福建Fujian98-1和Fujian00-1分别被划分在基因型B和C中,各基因型之间的核苷酸差异均大于20%。为验证该分型方法,将26株来自不同国家和时间的ECHO13病毒和2株福建分离ECHO13病毒部分VP1基因序列进行对比分析,建立进化树。结果显示,所有ECHO13病毒被分在A。 展开更多
关键词 肠道病毒 核苷酸 基因型 VP1基因 C基因 中国分离株 对比分析 同源性 遗传距离 划分
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虎纹蛙病毒主要衣壳蛋白基因的克隆及其序列 被引量:11
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作者 苗素英 何建国 +4 位作者 张利红 曾慷 王晓红 张旻 江静波 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期559-563,共5页
从新分离感染虎纹蛙的病毒培养细胞中提取病毒DNA作模板 ,用分别对应于蛙病毒 3型 (FV3)主要衣壳蛋白 (MajorCapsidProtein ,MCP)基因读码框两侧的寡核苷酸片段作引物进行PCR扩增 ,得到预期大小基因片段 ,进一步将此基因片段插入到pGE... 从新分离感染虎纹蛙的病毒培养细胞中提取病毒DNA作模板 ,用分别对应于蛙病毒 3型 (FV3)主要衣壳蛋白 (MajorCapsidProtein ,MCP)基因读码框两侧的寡核苷酸片段作引物进行PCR扩增 ,得到预期大小基因片段 ,进一步将此基因片段插入到pGEM T载体中 ,进行全长片段的序列测定和分析。结果表明 ,编码虎纹蛙病毒的MCP基因的读码框核苷酸数为 1392bp ,编码 4 6 3个氨基酸 ;基因的核苷酸序列与其他脊椎动物虹彩病毒的MCP基因序列比较结果显示 ,该病毒与蛙病毒属的FV3的同源性 (98% )明显高于囊肿病毒属的FLDV 1(5 2 % ) ,并且与虹彩病毒科其他成员的MCP基因序列均有所不同 。 展开更多
关键词 虎纹蛙 虹彩病毒 衣壳蛋白基因 克隆 病毒分类
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从我国分离的3株蛙虹彩病毒与蛙病毒3型主要衣壳蛋白基因同源性的比较 被引量:13
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作者 张奇亚 肖枫 +1 位作者 李正秋 桂建芳 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期372-374,共3页
Since 1995,three viral isolates named RGV9506,RGV9807 and RGV9808 associated with frog mortality were isolated from farm-raised frogs (Rana grylio virus,RGV) in China.Both ultrastructural morphology and serological ch... Since 1995,three viral isolates named RGV9506,RGV9807 and RGV9808 associated with frog mortality were isolated from farm-raised frogs (Rana grylio virus,RGV) in China.Both ultrastructural morphology and serological characterisitics had shown that the RGV isolates belong to genus Ranavirus. The DNA sequence analysis of the 5′end of the major capsid protein(MCP) gene of RGV isolates by PCR amplification produced a 531bp fragment.DNA templates were prepared from cells infected with different RGV isolates and the specific primers designed were based on highly conserved region at the 5′ of the gene encoding Frog virus 3(FV3) MCP, which is the typical species of the genus Ranavirus.The PCR products indicate that the nucleotide sequence of MCP gene of the RGV9506,RGV9807 and RGV9808 showed 99.6%, 99.8% and 98.4% homology respectively with the corresponding region of the MCP gene of FV3. 展开更多
关键词 蛙虹彩病毒 蛙病毒3型 FV3 聚合酶链式反应 衣壳蛋白基因 基因同源性 水产动物
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中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定 被引量:14
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作者 严维巍 崔治中 王永坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期447-449,共3页
应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆... 应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1株 ,在 1.0 m mol/ L IPTG和 37℃的条件下诱导 ,VP6 0 - GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western- blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的 870 0 0相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠 ,所得抗血清应用间接 EL ISA检测 ,与 RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明 ,大肠杆菌中表达的 RHDV VP6 展开更多
关键词 中国株 兔出血症病毒 衣壳蛋白 VP60基因 大肠杆菌 基因表达 免疫原性 鉴定 RT-PCR ELISA 病毒性出血症
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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析 被引量:20
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作者 刘怀然 陈洪岩 +4 位作者 关云涛 王云峰 李昌文 夏长友 张立成 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期321-324,共4页
自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为A... 自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%~ 98% ,氨基酸同源性为 94%~ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。 展开更多
关键词 出血症 病毒 衣壳蛋白 VP60 基因克隆 序列分析
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中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析 被引量:11
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作者 史成银 王印庚 +1 位作者 黄倢 王清印 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期588-593,共6页
应用同源PCR技术,从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620 bp的DNA片断.序列测定和Blast分析表明,该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)C末端编码区的DNA序列高度相似,由... 应用同源PCR技术,从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620 bp的DNA片断.序列测定和Blast分析表明,该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)C末端编码区的DNA序列高度相似,由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒,暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV).多序列比对和分析发现,TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99.47%(韩国大菱鲆虹彩病毒)、97%~98%(待指定病毒属的7种病毒),以及50%以下(蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒),由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树.研究结果表明,感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属,位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间,是该病毒属的一个新成员. 展开更多
关键词 大菱鲆 虹彩病毒 主要衣壳蛋白基因 聚合酶链反应 序列分析
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鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的原核表达 被引量:8
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作者 余旭平 胡东建 +3 位作者 郑新添 竺春 刘晓宁 于洪涛 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期505-509,共5页
根据已发表的鹅圆环病毒GoCV-yk1株的序列,设计引物扩增出全长核衣壳蛋白基因(Cap),用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳检测未见到目的蛋白条带。应用生物信息学... 根据已发表的鹅圆环病毒GoCV-yk1株的序列,设计引物扩增出全长核衣壳蛋白基因(Cap),用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳检测未见到目的蛋白条带。应用生物信息学分析确定Cap蛋白的核定位信号区域,新设计一对引物扩增出不包含核定位信号序列编码区的核衣壳蛋白基因,将截短Cap基因克隆入pET-28a进行融合表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot检测,截短Cap蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为27.6ku,表达产物以包涵体形式存在,其表达量可以达菌体总蛋白的18.3%。截短Cap蛋白的高效表达为鹅圆环病毒ELISA检测方法的建立和进一步开展GoCV致病性及其免疫机制的探索奠定了基础。 展开更多
关键词 圆环病毒 核衣壳蛋白基因 核定位信号 原核表达
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兔出血症病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达 被引量:15
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作者 严维巍 崔治中 王永坤 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期135-138,共4页
将RHDVVP6 0基因插入酵母转移载体pPICZB中转化毕赤酵母菌GS115株 ,经筛选获得染色体基因组中整合入VP6 0基因的重组酵母菌。以甲醇诱导培养后经SDS PAGE和Westernblot检测表达产物 ,在 6 0kD处出现一特异蛋白条带 ,表明RHDV的衣壳蛋白... 将RHDVVP6 0基因插入酵母转移载体pPICZB中转化毕赤酵母菌GS115株 ,经筛选获得染色体基因组中整合入VP6 0基因的重组酵母菌。以甲醇诱导培养后经SDS PAGE和Westernblot检测表达产物 ,在 6 0kD处出现一特异蛋白条带 ,表明RHDV的衣壳蛋白得到了成功表达。血凝试验表明 ,表达的重组蛋白具有血凝特性 ,可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2 8,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组酵母表达的衣壳蛋白可以在酵母菌体内自聚成大小约4 0nm ,和天然RHDV病毒子在物理形态上类似的病毒样颗粒 (VLPs)。该病毒样颗粒与兔抗RHDV高免血清作用后可被凝集成团 ,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白基因 毕赤酵母 表达 病毒样颗粒
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口蹄疫病毒P12A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建 被引量:8
13
作者 刘艳红 李炯 +3 位作者 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期606-610,共5页
以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMD... 以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88(L)P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C,为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 A型口蹄疫病毒 衣壳蛋白基因 蛋白酶基因 重组逆转录病毒表达载体
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在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白 被引量:7
14
作者 严维巍 崔治中 王永坤 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期333-337,共5页
将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经... 将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUE BAC4-VP60。以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Westernblot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性。血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213。同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs)。在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。 展开更多
关键词 表达 昆虫细胞 病毒样颗粒 重组杆状病毒 衣壳蛋白 VLP 重组蛋白 转移载体 高免血清 兔出血症病毒
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真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用 被引量:5
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作者 赵玉然 谭乐义 +7 位作者 刘荭 赵巍 梁成珠 史秀杰 徐彪 朱来华 何俊强 岳志芹 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2011年第2期111-116,共6页
以真鲷虹彩病毒(Red-sea breamiridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Pri mer Express3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。将RSIV MCP基因连接pMD18-... 以真鲷虹彩病毒(Red-sea breamiridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Pri mer Express3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.1841gX+40.270,相关系数R2=0.9969。熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃。该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性。利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析。 展开更多
关键词 真鲷虹彩病毒 实时定量PCR 衣壳蛋白基因 SYBR GreenⅠ
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中国大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)PCR检测方法的建立及其应用 被引量:4
16
作者 史成银 黄倢 +1 位作者 杨冰 刘莉 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期830-836,共7页
大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一。本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该... 大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一。本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该方法的特异性和灵敏度,并应用该方法开展了TRBIV的流行情况调查及研究了大菱鲆的外观症状(红体)与TRBIV感染的关系。结果显示,本研究建立的TRBIVPCR检测方法可以从相当于100ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1天的时间内完成大量样品的TRBIV检测,但不能从健康大菱鲆脾组织和患淋巴囊肿牙鲆的囊肿组织中扩增出任何产物,说明该方法具有很高的灵敏性和特异性;在所调查的山东半岛5家大菱鲆养殖场的19尾大菱鲆中,7尾为TRBIV阳性或弱阳性;具有"红体"症状的大菱鲆应当划分为"病毒性红体病"、"细菌性红体病"和"非病原性红体症"3种不同的类型。本研究为TRBIV的流行情况和传播途径调查、疾病的快速诊断和控制提供了技术手段;调查结果显示TRBIV已遍布山东半岛沿海地区的大菱鲆主产区,在地域上相距较远的多个大菱鲆养殖场流行,今后需要密切关注该病毒的传播和流行。 展开更多
关键词 大菱鲆 虹彩病毒 主要衣壳蛋白基因 PCR 检测
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一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析 被引量:10
17
作者 田浪 王红宁 +4 位作者 李建文 廖娟 张夏兰 周万蓉 王鸿宾 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1078-1083,共6页
从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒(RHDV),命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性;但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成... 从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒(RHDV),命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性;但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线;电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序,序列分析表明VP60基因序列全长1740bp,编码579个氨基酸,测序结果提交GenBank(注册号为DQ069280),并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较,结果表明核苷酸同源性为90.0%~98.0%,氨基酸同源性为94.1%~99.0%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区;同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株,丰富了地方毒株资源,为明确我国地方株的分子流行病学,以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 无血凝性 衣壳蛋白 VP60基因 序列分析 RT—PCR
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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 被引量:9
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作者 李炯 刘艳红 +4 位作者 安芳兰 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期376-382,共7页
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病... 为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳前体基因 绿色荧光蛋白基因 BHK-21细胞
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牛乳头瘤病毒基因2型流行株全基因组的克隆及序列分析 被引量:8
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作者 贺志昊 孟庆玲 +5 位作者 乔军 刘昱成 杨海波 王国超 才学鹏 陈创夫 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期183-188,共6页
为了解牛乳头瘤病毒(Bovine Papillomavirus,BPV)新疆流行株基因型及其基因组遗传变异情况,用乳头瘤病毒L1基因简并引物FAP59/FAP64对新疆沙湾县奶牛皮肤肿瘤组织样品进行PCR扩增,测序后确定,BPV基因型;设计6对BPV基因型特异性引物,经... 为了解牛乳头瘤病毒(Bovine Papillomavirus,BPV)新疆流行株基因型及其基因组遗传变异情况,用乳头瘤病毒L1基因简并引物FAP59/FAP64对新疆沙湾县奶牛皮肤肿瘤组织样品进行PCR扩增,测序后确定,BPV基因型;设计6对BPV基因型特异性引物,经扩增、测序、拼接后获得BPV流行株全长基因组序列。L1基因序列分析表明,BPV2-SW01流行株为BPV-2基因型;该毒株基因组全长7 944bp,包括E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3、E5、L2和L1 10个开放阅读框(ORF)。遗传进化树分析显示,BPV2-SW01归于Delta乳头瘤病毒属,与BPV-1和BPV-13进化关系最近。 展开更多
关键词 牛乳头瘤病毒基因2型 衣壳蛋白L1基因 全基因组序列 遗传进化分析
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斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价 被引量:3
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作者 黄桂菊 陈健光 +2 位作者 喻达辉 曾令兵 龙华 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期343-349,共7页
利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干... 利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 斜带石斑鱼 神经坏死病毒 CP基因 shRNA干扰载体
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