对克百威具高度特异性的免疫分析技术研究

合成了保留氨基甲酸酯结构的克百威半抗原 ,并采用活性酯法与载体蛋白质共价连接制备突出克百威分子结构特征的合成抗原。以合成抗原免疫新西兰白兔获得对克百威具高亲合力的抗血清 ,采用硫酸铵盐析和 DEAE纤维素反相吸附法分离和纯化抗体。以辣根过氧化物酶采用改良的过碘酸钠法标记抗体、混合酸酐法标记半抗原。在此基础上分别建立了对克百威具高度特异性的间接竞争 ,包被抗原、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定 ( ELISA)法。在优化条件下 ,克百威测定的线性浓度范围为 1 0 0 ～ 1 0 - 4 μg/m L,检测限≤ 0 .0 1 ng/m L,其他常用氨基甲酸酯类杀虫剂和呋喃酚不干扰克百威的测定。

呋喃丹免疫半抗原的合成与应用

以呋喃丹、对硝基苯氯甲酸酯和6-氨基己酸合成呋喃丹半抗原:6-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH).将半抗原与载体蛋白(BSA,OVA)偶联制备呋喃丹人工免疫抗原和包被抗原.利用BFNH-BSA免疫家兔获得抗呋喃丹的多克隆抗体,并通过间接ELISA法测定抗体的效价.结果表明,家兔抗血清效价达1.28×106.采用正辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯化抗体,纯化后抗体效价达到1.024×107,经10%SDS-PAGE分析,重、轻链分子量分别约为55kD和22kD.

小鼠CD40胞外段的原核表达及多克隆抗体的制备

为了探讨CD40抗体与CD40结合对B细胞应答小分子半抗原的增强作用,利用TRIzol法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA,并反转录成cDNA;根据CD40的胞外段CDS设计引物,通过PCR扩增目的基因,构建pGEX4T-1-CD40表达载体,进行原核表达及多克隆抗体制备。结果表明,成功扩增了522 bp的目的基因,表达并纯化获得了45 ku的CD40重组蛋白,多克隆抗体抗体不但可与重组蛋白结合,与小鼠脾脏天然CD40蛋白也可以特异性结合。说明CD40重组蛋白表达成功,且制备的抗体有望模拟CD40L为B细胞活化提供第二信号。