氟对体外培养大鼠成釉细胞HAT-7细胞活性和对细胞内Ca^(2+)浓度的影响

目的:观察氟对体外培养的大鼠成釉细胞HAT-7细胞活性及细胞内Ca2+浓度的影响。方法:取对数生长期的HAT-7细胞,分别加入不同浓度的Na F培养液,培养24、48、72 h后,用CCK-8检测细胞的活性;流式细胞术分析氟对细胞凋亡的影响;激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子的浓度。结果:Na F浓度为0.4、0.8 mmol/L时,促进成釉细胞增殖;当Na F浓度大于1.6 mmol/L时,促进成釉细胞凋亡,Na F浓度为1.6 mmol/L时,细胞早期凋亡数量增加,激光共聚焦显微镜检测证实,1.6mmol/L Na F可以诱导大鼠成釉细胞内Ca2+浓度升高,Na F对HAT-7细胞的上述作用与浓度和作用时间呈正相关。结论:低浓度氟促进HAT-7细胞增殖,高浓度则抑制其增殖。Na F浓度超过1.6 mmol/L时,可诱导成釉细胞凋亡,并诱导成釉细胞内Ca2+浓度增加。

Ca^(2+)在茉莉酸甲酯诱导拟南芥气孔关闭中的信号转导作用

以拟南芥叶片下表皮为材料 ,分别用表皮生物分析法和激光扫描共聚焦显微镜成像技术 ,研究茉莉酸甲酯 (JA Me)促进气孔关闭过程中胞质Ca2 + 浓度的变化及其与气孔关闭的关系。结果表明 ,10 - 7到 10 - 3mol L的JA Me处理能促进拟南芥叶片的气孔关闭 ,其中 ,10 - 5mol L是最适浓度。用 10 - 5mol L的JA Me处理5min ,胞质Ca2 + 浓度从静息态的 10 5nmol L增加到 332 0nmol L ;质膜Ca2 + 通道阻断剂LaCl3和Ca2 + 螯合剂EGTA均能明显地降低JA Me对气孔关闭的促进作用。由此推测 ,胞质Ca2 + 可能是JA

比较布比卡因和罗哌卡因对大鼠心室肌细胞Ca^(2+)移动的影响

目的:应用激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度的布比卡因和罗哌卡因对大鼠心室肌细胞Ca2+移动的影响,比较它们的心肌毒性。方法:原代培养新生SD大鼠的心室肌细胞,应用激光扫描共聚焦显微镜观察心室肌细胞内钙荧光强度的变化,比较不同浓度的布比卡因和罗哌卡因对KCl诱导的荧光强度峰值的影响。结果:10μmol/L时两种局麻药对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内钙荧光强度的变化无显著影响;50μmol/L和100μmol/L时两种局麻药明显抑制细胞内钙荧光强度的变化;相同浓度的布比卡因抑制作用大于罗哌卡因。结论:同浓度布比卡因对心室肌细胞Ca2+移动的抑制作用大于罗哌卡因,表明布比卡因心肌毒性大于罗哌卡因。

铁离子对Caco-2细胞内钙离子转运的影响及钙离子浓度变化与细胞凋亡关系的研究

目的 研究细胞外铁离子(Fe3+)浓度变化对钙离子(Caco 2)细胞内Ca2+转运的影响及细胞内钙离子 浓度升高与Caco 2细胞凋亡的关系。 方法 采用激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞技术进行观察与检测。 结果 (1)利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察发现,随着Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少(DFO终浓度为100～ 300μmol L),Ca2+向细胞内的转运量增加;而随着细胞外Fe3+浓度的增加(FAC终浓度为10～100μmol L),Ca2+向细 胞内的转运呈降低趋势;(2)经A23187和Fluo 3 AM处理后Caco 2细胞的存活率较高,达90%以上(用荧光素二醋酸 酯检测);(3)A23187升高Caco 2细胞的胞内Ca2+浓度,呈剂量依赖性;经流式细胞技术(FCM)检测发现胞内Ca2+浓度 增加具有诱导Caco 2细胞凋亡的作用。 结论 Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少有促进Ca2+向细胞内转运的作用, 但胞外Fe3+浓度增加时有抑制Ca2+向胞内转运的作用;胞内Ca2+浓度增加对Caco 2细胞凋亡具有诱导作用。

水蛭对Ang-Ⅱ刺激鼠肝星状细胞活化Ca^(2+)效应的抑制作用

目的研究水蛭药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙([Ca^(2+)]i)增高的作用。方法将32只健康SD大鼠按随机数字表随机分为4组肝纤维化模型水蛭组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCl4溶液9周,然后灌服水蛭6d;肝纤维化模型对照组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCl4溶液9周,然后灌服0.9%氯化钠溶液6d;正常大鼠水蛭组(8只)仅皮下注射等量的精制橄榄油9周,然后灌服水蛭6d;正常对照组(8只)仅皮下注射等量的精制橄榄油9周,然后灌服0.9%氯化钠溶液6d。结束后,经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法用上述10%血清培养HSCs24h并负载好Fluo-3/AM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测HSCs[Ca2+]i。结果(1)经正常大鼠水蛭组及肝纤维化模型水蛭组大鼠血清预处理的HSCs,其[Ca^(2+)]i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P<0.05);且两者与正常对照组间差别也均有显著性意义(P<0.05)。(2)经正常大鼠水蛭组及肝纤维化模型水蛭组大鼠血清预处理HSCs后加入Ang-Ⅱ(1.1×10-7mol/L),HSCs[Ca^(2+)]i荧光强度变化百分数显著低于肝纤维化模型对照组(P<0.01)。结论水蛭能抑制肝星状细胞活化[Ca^(2+)]i的升高,此可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。

小麦叶肉细胞原生质体中微管骨架的排列格局与[Ca^(2+)]_(cyt)的关系

以小麦叶肉细胞原生质体为材料,通过免疫荧光标记和Ca^(2+)荧光染料的装载并结合药物学试验,借助激光共聚焦扫描显微镜观察,探讨微管骨架和Ca^(2+)之间的内在联系。试验结果表明,[Ca^(2+)]_(cyt)的升高能够诱发微管骨架的解聚;而微管骨架的解聚也会促使胞外Ca^(2+)内流,进而造成[Ca^(2+)]_(cyt)的升高。

单细胞内Ca^（2＋）时空变化的激光共聚焦显微测定

应用激光扫描共聚焦显微系统（ＬＳＣＭ）和Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ荧光探剂标记技术，测定了单个活细胞胞内游离Ｃａ２＋的动态变化与立体分布影像．结果显示，在３７℃，Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ终浓度为６μｍｏｌ／Ｌ的条件下，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠巨噬细胞负载１ｈ左右即可获得良好的标记效果．相反，若探剂浓度太高或负载时间太长，胞内荧光强度太强，影响在共聚焦显微镜镜下分辨细胞内结构．因此用ＬＳＣＭ研究细胞内游离Ｃａ２＋变化时，荧光探剂的负载应以获得最适荧光信号而不是以最大荧光强度为标准．上述方法在其他如平滑肌细胞、卵母细胞中的测定亦获得满意的结果，这对进一步研究各种生理和病理条件下细胞内Ｃａ２＋信号的动态变化、与跨膜Ｃａ２＋梯差的关系及对活细胞功能活动的调节提供了一种可行的、直观的研究手段。

吗啡成瘾性大鼠脑内核团神经细胞[Ca^(2+)]i变化的研究

目的研究吗啡成瘾对大鼠脑内与成瘾相关核团神经细胞[Ca2+]i的影响。方法将50只SD大鼠随机分成吗啡成瘾组和对照组,观察成瘾后的戒断症状;应用对Ca2+敏感的探针Fluo-3与Ca2+络合后被激光激发发出荧光的特性,利用激光共聚焦显微镜观察伏核、海马、内侧额前皮质神经细胞[Ca2+]i变化,并用图像分析软件进行处理。结果吗啡成瘾大鼠脑内伏核、海马及内侧额前皮质神经细胞[Ca2+]i和对照组比较明显增高(P<0.01)。结论长期使用吗啡可明显增高伏核、海马和内侧额前皮质神经细胞[Ca2+]i。

甜菜碱对HepG_2人肝癌细胞[Ca^(2+)]_i和细胞膜电位的影响

目的研究甜菜碱对肝癌HepG2细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和细胞膜电位的影响。方法Fluo-3/AM标记,激光扫描共聚焦显微镜观察HepG2细胞[Ca2+]i,TMRE标记,激光扫描共聚焦显微镜测定细胞膜电位的影响。结果甜菜碱能够升高HepG2细胞[Ca2+]i,降低细胞膜电位。升高[Ca2+]i的强度具一定的剂量依赖性,随甜菜碱剂量的增大而升高。甜菜碱50、25mg/mL组与对照组比较差异非常显著(P<0.01),甜菜碱12.5mg/mL组与对照组比较差异显著(P<0.05)。给药48h时间段内细胞内的[Ca2+]i升高的幅度较大,72h升高幅度相对较小。而降低膜电位上,在48h时间段内,甜菜碱50、25、12.5mg/mL各组膜电位均显著高于对照组(P<0.05),但在72h时间段内甜菜碱12.5mg/mL组与对照组比较没有显著性差异(P>0.05)。结论甜菜碱通过开放细胞膜上的通透性转换孔道(MPTP),从而升高HepG2细胞[Ca2+]i,启动细胞凋亡机制,诱导HepG2细胞凋亡。

亚低温对大鼠脊髓损伤后[Ca^(2+)]_i的影响

目的 观测大鼠脊髓损伤后一定时段脊髓组织内 [Ca2 + ]i 的动态变化及亚低温对其的影响。方法 应用激光共聚焦显微镜观测亚低温对大鼠脊髓损伤后 [Ca2 + ]i的影响 ,并与钙组化染色相对照。结果 大鼠脊髓损伤后 [Ca2 + ]i 明显升高 ,至伤后 8h达高峰 ,伤后立即 (5min)亚低温治疗明显减轻细胞内钙聚现象 ,但与对照组相比 ,不能完全阻止 [Ca2 + ]i 的上升。结论 [Ca2 + ]i 升高是脊髓继发损伤病理机制中的重要因素 ,亚低温减轻 [Ca2 + ]i 升高是其脊髓保护机制之一。钙组化染色结果支持上述论点 ,但很难对 [Ca2 + ]i 进行准确快速的动态检测。

三疣梭子蟹精子顶体反应前后胞内Ca^(2+)的变化

应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和Fluo-3/AM荧染技术对三疣梭子蟹精子顶体反应前后的胞内Ca2+变化进行了观察和检测。结果显示,在精子顶体反应过程中,胞内Ca2+主要分布在细胞核、穿孔器和胞质膜残存处,胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)总体上呈现先上升后下降的趋势。顶体反应前精子的平均荧光强度为35.95±5.71;穿孔器前伸、顶体囊膜翻转阶段精子的平均荧光强度为66.80±7.35;顶体囊膜脱落、顶体丝形成阶段精子的平均荧光强度为3.87±2.82;上述各阶段间精子荧光强度有极显著差异(P<0.01)。顶体反应穿孔器前伸、顶体囊膜翻转阶段的精子相比顶体反应前精子,[Ca2+]i显著提高;而在顶体囊膜脱落、顶体丝形成阶段,[Ca2+]i则急剧下降,只在顶体丝基部胞质膜残存处有微量Ca2+存在。初步探讨了三疣梭子蟹精子顶体反应前后胞内Ca2+变化的功能。

胃动素对胃窦平滑肌细胞内Ca^(2+)浓度的影响及机制

目的:观察胃动素对新生大鼠胃窦平滑肌细胞内Ca2+浓度的影响及机制。方法:采用激光共聚焦显微镜结合细胞内荧光染色观察不同条件下相同浓度胃动素对培养大鼠胃窦平滑肌细胞内Ca2+浓度的影响。结果:细胞膜Ca2+通道阻断剂维拉帕米、含Ca2+螯合剂EGTA的D-Hank’s液及细胞内Ca2+释放阻断剂TMB-8均可不同程度抑制MTL对胃窦平滑肌细胞内Ca2+的升高作用。结论:MTL具有升高胃窦平滑肌细胞内Ca2+的作用,细胞外Ca2+内流和内Ca2+释放参与了这种作用。

实时监测GHRP对心肌细胞内[Ca^(2+)]i和NO调控的双标记方法研究

目的探索实时监测GHRP对心肌细胞内[Ca2+]i和NO调控的双标记方法,为研究GHRP对心脏直接保护效应机制提供新方法。方法用改良的Langendorff恒流灌注仪系统和酶解法急性分离SD成年大鼠心肌细胞,在LSCM下分别以Ca2+探针Rhod-2/AM和NO探针DAF-FM/DA对心肌细胞内Ca2+和NO进行双标记并观察GHRP即时刺激对两者的调控影响。结果在LSCM下心肌细胞内Ca2+呈红色荧光,NO呈绿色荧光,两者双标记后呈现黄绿色荧光,GHRP使红色荧光出现瞬时增强后又迟缓地回降,绿色荧光强度没有明显变化,双标记下GHRP对两者的调控同单标记结果。结论LSCM下实验中设计的双标记方法能实时监测成年大鼠心肌细胞内Ca2+和NO存在及GHRP对两者同一时相调控作用,引起[Ca2+]i两个时相的变化,而对NO信号系统未见明显影响。

蛙皮素对PC-3细胞骨架及细胞内游离Ca^(2+)的影响

目的:观察蛙皮素(BBS)对前列腺癌PC-3细胞骨架形态及细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)浓度的影响。方法:①利用免疫荧光法(IH),结合激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测10-5mol/L浓度BBS处理的PC-3细胞角蛋白(CK)的表达,以反映其对细胞骨架形态的影响;②应用Fluo-3/AM荧光标记技术和LSCM检测不同浓度BBS(10-9、10-7、10-5mol/L)处理的PC-3细胞[Ca2+]i浓度。结果:①10-5mol/L浓度的BBS可促进PC-3细胞CK表达及伪足形成;②BBS可提高PC-3细胞[Ca2+]i浓度,并具有浓度依赖性。结论:实验证明一定浓度的BBS可明显提高PC-3细胞[Ca2+]i浓度及CK表达,进而影响PC-3细胞骨架形态。本研究为探索BBS应用于肿瘤研究以及BBS作用后细胞内信息传递途径提供了基础。

活体小鼠脑组织Ca^(2+)敏感荧光染料双光子成像的观察

使用双光子激光共聚焦显微镜对活体小鼠脑组织(体感皮层)进行形态学和细胞内Ca2+变化水平的观察和记录。方法是对小鼠开颅后向脑内注射Ca2+敏感荧光染料Oregon Green 488 BAPTA-1乙酰氧基甲酯,然后在双光子显微镜下观察并记录。双光子显微镜下的图像清晰生动,可扫描到大脑皮层以下较深区域,并能检测神经元细胞内Ca2+离子即时水平变化。实验结果表明通过注射Ca2+敏感荧光染料并结合多光子激光共聚焦显微镜观察活体动物脑部变化的方法可以得到高分辨率图像并且作为分析的来源。

烟草悬浮细胞在凋亡过程中Ca^(2+)分布的共聚焦显微成像研究

以Fluo-3AM为游离Ca^(2+)荧光探针,利用激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)对烟草悬浮细胞在热激诱导的凋亡过程中Ca^(2+)时空分布进行了研究。结果显示,在正常细胞中,Ca^(2+)集中分布在细胞壁和细胞核中,细胞质中分布较少;在凋亡早期细胞中,细胞质中Ca^(2+)的浓度增加;在凋亡晚期的细胞中,细胞核中的Ca^(2+)浓度增加较为明显。结果提示,在凋亡过程中,Ca^(2+)的定位分布存在一定的规律。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的心肌样细胞内Ca^(2+)和CaMKⅡ的变化

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone m arrow m esenchym al stem cells,MSCs)体外诱导分化为心肌样细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达变化。方法取健康SD大鼠骨髓,用5-氮杂胞苷体外诱导培养。取诱导培养2、3、4周的MSCs为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,另取急性分离的心肌细胞为对照组,分别用激光共聚焦技术和W estern b lot技术检测[Ca2+]i及CaMKⅡ表达水平。结果经荧光探针结合Ca2+后,用激光共聚焦技术检测发现,随诱导培养时间的延长,[Ca2+]i逐渐增加;诱导培养4周的MSCs内[Ca2+]i与对照组比较无显著差异[(100.81±17.64),(100.32±17.10),P>0.05]。各组细胞CaMKⅡ的变化趋势与[Ca2+]i定量分析结果相似,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组分别为(322.45±19.43)、(434.43±16.77)、(680.91±20.61)、(682.69±21.03),Ⅲ组与对照组比较P>0.05。结论大鼠MSCs在体外诱导培养4周后已分化为心肌样细胞,其细胞内游离钙浓度和CaMKⅡ蛋白表达水平与正常心肌细胞相似。

Effect of solanine on the membrane potential of mitochondria in HepG_2 cells and [Ca^(2+)]i in the cells

瞄准：在 HepG (2 ) 房间在线粒体的膜电位上观察茄硷的效果，并且揭开并且[Ca (2+)] 在房间的(i) 茄硷由导致 apoptosis 的机制。方法：HepG (2 ) 房间是双的与 AO/EB 染色了，并且房间的词法变化被观察使用激光共焦的扫描显微镜学(LCSM ) 。HepG (2 ) 房间与 TMRE 被染色，并且在在房间的线粒体的膜电位的变化用 LCSM 被观察。HepG (2 ) 房间是双的与 Fluo-3/AM，和变化染色了[Ca (2+)] 在房间的(i) 用 LCSM 被观察。HepG (2 ) 房间是双的染色了与 TMRE 和 Fluo-3/AM，和两个在线粒体和的膜电位的变化[Ca (2+)] 在房间的(i) 用 LCSM 被观察。结果：在对待的组的房间显示出 apoptosis 的典型符号。与 TMRE 染色显示出那茄硷能更低的膜电位；与 Fluo-3/AM 染色证明茄硷能在肿瘤房间增加 Ca (2+) 的集中；并且那些两倍与 TMRE 和 Fluo-3/AM 染色证明当它降低了线粒体的膜电位，茄硷能在一样的时间在房间增加 Ca (2+) 的集中。结论：茄硷由降低膜电位在膜开创磅隧道，导致 Ca (2+) 在它的集中坡度下面被搬运，它接着在房间导致 Ca (2+) 的集中的上升，打开为 apoptosis 的机制。

培养的大鼠海马神经元胞内Ca^(2+)和NO双标记方法研究

以培养8～10天的大鼠海马神经元为对象,选择CalciumOrangeAM和DAF-FMdiacetate为Ca2+和一氧化氮(NO)的荧光指示剂,建立了基于激光扫描共聚焦显微技术的细胞内Ca2+和NO双标记检测方法.此方法对Ca2+和NO进行分步染色,然后应用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的双轨迹(TwoTrack)模式,通过快速切换激光实现对细胞内Ca2+和NO的同时检测.实验结果显示,两种染料之间无串扰现象;在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)刺激下,海马神经元胞内Ca2+快速升高,随后达到平台期并有波动,NO则稳定持续升高,这些变化过程与单标记的结果一致;双标记层切序列图像显示细胞内Ca2+和NO都较集中分布于细胞中部,但在细节上两者的分布存在差异.此双标记方法能同时检测培养的海马神经元胞内Ca2+和NO,为研究神经元胞内Ca2+和NO的相互调控作用提供了一种新的手段.

不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca^(2+)的影响

目的:探讨不同浓度维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞内Ca2+浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca2+浓度的变化。方法:2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/LVer作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)测定细胞内Ca2+荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果:Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义(P>0.05),Ver可降低RPE细胞内Ca2+荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca2+荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异(P<0.05)。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca2+荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异(P>0.05)。结论:超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca2+荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca2+有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca2+荧光强度无明显作用。