天津地区养殖鲤鱼(Cyprinus carpio)鲤浮肿病毒(CEV)PCR检测与人工感染试验

对2015—2016年天津地区鲤鱼养殖场采集的发生鲤浮肿病毒(CEV)/锦鲤睡眠病(KSD)的鲤鱼样品,进行套式PCR检测和人工浸泡感染试验,并测定养成期鲤鱼感染率。实验观察研究发现,所采集样品均表现为体色发黑,头部上方颅骨软组织周围皱缩,眼球凹陷,鳃粘脏,黏液较多,常滞游于浅水区水面。套式PCR检测结果显示全部10个样品均出现特异性目的条带,为CEV阳性。目的产物测序后经NCBI BLAST,与已报道的CEV相关序列相似性介于85%—99%;系统发育树分析显示样品编号JY1856与JY1650位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较近,而其余8个样品位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较远。通过人工浸泡感染健康鲤鱼,半数致死时间为55d,累计死亡率为71.1%±3.2%,并从试验感染鱼组织中检测到CEV病毒DNA。养成期鲤鱼CEV携带率为77.5%。以上结果表明,天津地区养殖鲤鱼中存在CEV感染,揭示了我国鲤鱼养殖产业可能面临新的疫情,需引起养殖业的高度重视。

鱼类病毒(SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV)LAMP联检方法的建立和应用

建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒3(CyHV-3)、鲤鱼浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)等4种鱼类常见病毒的环介导等温扩增技术(LAMP)联合检测方法。基于4种鱼类病毒的基因保守区分别设计LAMP引物组,优化反应体系和条件,筛选测试出特异性和灵敏度最佳的引物组,建立4种鱼类常见病毒的联合检测LAMP方法,同时以市售的荧光定量检测试剂盒测试结果作为对照,评估建立的联合检测LAMP方法的准确性。结果显示,筛选出的SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的LAMP引物组特异性均良好,优化后的体系反应条件均为63℃,60 min,其中SVCV和CyHV-3均可检测到10 fg/μL,CEV和VNNV可检测到1 fg/μL。应用建立的4种病毒联合LAMP检测方法和市售的各荧光定量PCR检测试剂盒对150份收集的组织样本进行平行测试,联合LAMP检测方法的准确率为100%。建立的鱼类病毒LAMP联检方法能够准确、高效、快速地在鱼类组织样本中同时对SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV进行检测,适合水产养殖现场检测,对病毒的监测和快速诊疗起到重要作用。

江苏地区一株鲤浮肿病毒的检测和系统进化分析

为及时掌握江苏省水生动物重大疫病流行趋势以便采取控制措施,应用国标或行标方法对江苏地区某养殖场的健康鲤鱼样品进行水生动物重大疫病监测,检测了锦鲤疱疹病毒(koi herpes virus, KHV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)和鲤浮肿病毒(carp edema virus, CEV)。结果显示CEV阳性,系江苏省首次检出CEV。基于CEV P4a基因进行系统进化分析,结果显示该病毒与NCBI序列号为KY024583.1的CEV亲缘关系最近。该研究可为江苏省鲤浮肿病毒的流行传播规律探寻、疾病诊断和防控提供重要依据。

养殖锦鲤鲤鱼浮肿病的检测与鉴定

北京房山某锦鲤养殖场锦鲤发生大量死亡,患病锦鲤呈烂鳃、肾脏糜烂、身体浮肿;症状类似锦鲤疱疹病毒(koi herpes virus,KHV)感染,但经PCR检测排除了KHV感染。为进一步确定病原,对发病鱼进行了临床症状观察、病毒分离、细菌分离培养、病鱼组织超薄切片电镜观察和PCR扩增等检测。通过病鱼组织超薄切片电镜观察,在肾脏内可见200nm×400nm的痘病毒样颗粒。抽提病毒核酸后,用已知的鲤鱼浮肿病毒(carp edema virus,CEV)的保守序列设计2对引物进行PCR扩增,扩增出548和180bp片段,测序结果和GenBank公布的CEV H504株序列完全一致。根据发病鱼临床症状和实验室检测结果,最终确定该病为CEV引起的鲤鱼浮肿病。这是在中国首次发现的鲤鱼浮肿病。

四川地区养殖锦鲤浮肿病毒检测与系统进化分析

2017年10月,四川省某锦鲤养殖场暴发一种以嗜睡、腹部肿大、鳃肿胀和眼睛凹陷为临床特征的传染病,累计死亡率高达50%。为研究锦鲤发病病因和疾病流行规律,对病鱼解剖,进行病理组织观察、电镜观察、PCR检测和系统进化分析。结果显示,患病锦鲤眼球浑浊,腹部肿大,鳃肿胀严重;组织病理学观察发现病鱼的鳃、肝脏、肾脏和脑组织细胞变性、坏死,出现大量炎性细胞浸润;透射电镜观察,在肾脏组织中发现病毒粒子。巢氏PCR方法检测鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV),出现特异性扩增产物;基于CEV P4a基因进行系统发育分析,此病毒与英国株R083同源性为99%。本研究为鲤浮肿病毒的起源进化、分类、疾病诊断和防控提供重要依据。

我国北方地区鲤浮肿病毒的流行情况调查与监测分析

为进一步确认及掌握鲤浮肿病毒(Carp Edema Virus,CEV)目前的流行现状和流行特点,于2017年重点调查了我国北方地区5省市26个正发生或曾经发生"鲤急性烂鳃病"的养殖场,随机监测了9个省市的97家鲤和锦鲤养殖场。样品采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,q PCR)法和套式PCR(Nest PCR)方法进行检测,nest PCR法扩增出的产物进行测序和基因分析。结果重点调查的26家养殖场中有20个为CEV阳性,1个为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpes Virus,KHV)阳性,1个为孢子虫感染。随机调查的97家养殖场中有50家为CEV检测阳性,阳性率高达52%;可测序的CEV毒株均属于GenogroupⅡa型;样品按不同地区、不同采样水温、不同品种、不同规格鱼等划分,各组均有CEV阳性检出,但检出率均无显著差异。以上结果表明CEV感染是多省市"鲤急性烂鳃病"暴发的主要病因。另外,该病毒病的流行水温在12—27℃。

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus,CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg2+浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L,Betaine 0.7 mol/L,Mg2+8.0 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍;CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。

感染鲤浮肿病毒镜鲤的组织病理变化及病毒分布规律研究

【目的】研究感染鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)镜鲤的组织病理特征及CEV在各组织中的分布规律,以期为鲤浮肿病的诊断和防控提供参考。【方法】利用HE染色观察发病镜鲤心脏、肝脏、皮肤、脾脏、肾脏、脑、鳃组织的病理变化情况;用免疫组织化学法检测CEV在镜鲤各组织的分布和蛋白表达情况;利用CEV P4a基因保守区域设计3条探针,于5′-端标记FAM进行原位杂交,检测CEV在镜鲤各组织的核酸分布情况;实时荧光定量PCR检测感染镜鲤各组织的病毒载量。【结果】HE染色观察发现,患病镜鲤的鳃丝肿胀、充血,鳃丝间有脱落堆积的红细胞和炎性细胞,肝脏细胞深染萎缩,胆小管出血,脾脏组织出现明显间隙并伴有出血,肾脏组织充血明显,肾小管有明显闭合现象。免疫组织化学结果显示,在患病鱼的鳃和肝脏组织中大量表达CEV P4a蛋白,在其他组织中也有少量表达。原位杂交结果显示,CEV核酸大量存在于鳃组织中,在心脏、脾脏和肾脏中均有少量阳性信号。实时荧光定量PCR结果显示,鳃组织病毒载量极显著高于心脏、肝脏、皮肤、脾脏、肾脏、脑组织(P<0.01)。【结论】感染CEV后,镜鲤内脏组织出现不同程度充血、出血,病毒主要分布在鳃,说明鳃是CEV增殖的最主要靶器官。

鲤鱼浮肿病流行情况的初步研究

为了明确北京顺义某锦鲤养殖场患病锦鲤的发病死亡原因,根据鲤鱼浮肿病毒基因的保守序列设计引物进行套式PCR扩增,产物经电泳后可见548 bp片段和180 bp片段的DNA条带,空白对照无扩增条带;套式PCR的产物进行测序,测序结果和Genbank公布的鲤鱼浮肿病毒H504株序列完全一致。结果显示这是由鲤鱼浮肿病毒引起的鲤鱼浮肿病,并通过进一步分析,提示鲤鱼浮肿病在北京地区已经有所扩散,应引起养殖者以及鱼病工作者的关注。

养殖鲤和锦鲤中的鲤浮肿病毒检测与分析

鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV)是一种严重危害养殖鲤和锦鲤的病毒。2014年在北京地区确诊的首例鲤浮肿病意味着该病已进入中国。为调查CEV在养殖鲤、锦鲤中的流行现状,同时筛选适宜的CEV普查方法,探索其发病条件,试验于2016年5月至2016年9月共采集13个样品,采用日本学者建立的Nest-PCR法及英国学者研究的Nest-PCR法、Real-time PCR法进行CEV检测。结果发现,13个样品中共检测到5个CEV阳性,3个为锦鲤样品,2个为普通鲤或杂交鲤样品。Real-time PCR法检出所有阳性,日本的Nest-PCR法检出3个锦鲤阳性和1个普通鲤阳性,英国的Nest-PCR法仅检出3个锦鲤阳性。在阳性样品中,3号和10号样品的养殖鱼并未发病死亡,且3号样品鱼体内的病毒拷贝数高于有临床症状并出现死亡的7号、8号和13号样品。说明目前养殖鲤、锦鲤的CEV阳性率较高,亟需加强该病毒的监测、防控。英国学者建立的Real-time PCR法不会漏检,更适合用于中国CEV的监测普查。没有外界环境条件刺激,养殖鱼即使感染CEV或CEV在其体内增殖,也不一定发生鲤浮肿病。结合鲤浮肿病发病温度范围较宽,提示环境条件刺激才是导致该病发生的关键因素,避免环境刺激是降低该病发生的一个有效措施。

鲤浮肿病毒RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测鲤浮肿病毒(CEV)的方法,本研究联合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RAA下游引物和探针的5’端分别进行Biotin和FAM标记,通过RAA反应时间和温度等条件的优化,建立了可用于CEV现地检测的RAA-LFD方法。该检测方法在34℃~40℃恒温反应10 min即可实现对CEV目的基因片段的有效扩增;与其它常见水生动物疫病病原DNA无交叉反应;RAA扩增产物可以直接对LFD经肉眼观察结果,该方法对标准质粒pEASY-CEVP4a的最低检测限为6拷贝/μL,与荧光定量PCR灵敏度相当;组内和组间重复性试验表明该方法具有良好的重复性和稳定性;采用该方法和荧光定量PCR对60份临床样本同时进行检测,二者的阳性符合率为96.08%。本研究建立的RAA-LFD检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方便,可用于CEV的临床快速检测。

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。

从江县鲤爆发性死亡病例实验室诊断

2018年10月贵州省从江县某水产养殖专业合作社鲤爆发死亡,本研究对死亡病例进行了流行病学调查、病理学观察、寄生虫学检查、细菌分离鉴定和病毒PCR检测等诊断。结果显示:病鲤病变以鳃丝溃烂、体表出血、肛门红肿和眼球凹陷为主要特征,组织的主要病变是肾小球萎缩出血、肾小囊空腔、鳃丝肿胀粘连及上皮细胞脱落等;细菌分离培养可得到圆形凸起、表面光滑的灰白色菌落,经染色镜检、生理生化鉴定和16S rRNA基因测序分析,鉴定该分离菌为嗜水气单胞菌;PCR检测显示鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)为阳性,未检出鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)和鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV);显微镜观察亦未见到寄生虫虫体;分别取分离菌和鲤浮肿病毒阳性病例组织悬液进行人工感染试验,均可引起健康鲤发生死亡。上述结果表明,从江县鲤的死亡是嗜水气单胞菌和鲤浮肿病毒混合感染所致。

鲤浮肿病毒人工感染锦鲤的试验研究

为研究鲤浮肿病毒的感染方式及在锦鲤各组织器官中的动态分布,在水温20～22℃,溶解氧7～8mg/L试验条件下,采用注射、浸泡、划伤后浸泡3种方式人工感染锦鲤,观察了试验鱼的发病和死亡情况;检测了鲤浮肿病毒在感染鱼体内各组织器官中的存在情况,探讨了主要被感染组织的病理变化。试验结果显示,采用注射、浸泡、划伤后浸泡3种方式均可导致健康锦鲤感染该病毒,病鱼出现昏睡、烂鳃、凹眼等症状,累积死亡率35%～88%。锦鲤感染该病毒后至少有3d的潜伏期,随后病毒在鳃组织中大量增殖,至7d达到高峰,病毒量314.8个/ng,之后病毒量开始逐渐下降,至12d在鳃组织中检测不出病毒。鲤浮肿病毒在肾、肝、脑、肌肉和脾中存在的时间较短且病毒量较低,在血液和肠道中未检出。结合鳃组织病理切片可知,鳃为该病毒感染的主要靶器官。本研究结果为鲤浮肿病的诊断和防控提供了一定的科学依据。

鲤浮肿病毒传入风险分析

为评估鲤浮肿病毒(CEV)跨境传播风险,提出科学可行的防控措施,基于病原学和流行病学特征,对CEV进入我国的可能因素进行了风险分析。分析认为,CEV的传入威胁主要来自疫区的活养殖鲤、锦鲤,以及金鱼等其它活敏感鱼类,其次是用于食用的活敏感鱼类,以及冰冻、冰鲜的敏感鱼类。因此,根据进口对象,制定不同的风险管理方案并采取相应的检疫措施,对有效控制CEV传入我国具有重要意义。

鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价

鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)是在锦鲤中发现的一种传染性病毒病,近年来在全球传播迅速,对鲤养殖业造成严重损害。本研究设计CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行特异性实验;选取套式PCR、荧光PCR和LAMP三种检测方法,组织10家实验室进行室间比对测试:制备含CEV病毒核酸的测试样品,评价其均匀性和稳定性,通过测试结果分析方法检出限。结果显示,套式PCR的核酸样品检测限可达6.8×10^(-10) g。

鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法的建立及初步应用

鲤浮肿病毒(Carp Edema Virus,CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kio Herpes Virus,KHV)皆可感染锦鲤,对锦鲤养殖造成严重危害。本研究旨在建立一种可同时检测CEV和KHV的三重PCR检测方法。参考日本学者Oyamatsu等建立的nest-PCR方法和锦鲤疱疹病毒行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分:锦鲤疱疹病毒》,分别选取扩增CEV P4a基因的548 bp片段,KHV TK基因的409 bp片段和KHV Sph基因的292 bp片段的3对特异性引物进行组合,考虑多重PCR扩增过程中的影响因素,优化退火温度和引物浓度,进行敏感性和特异性试验。结果显示,该方法能特异地扩增出3条目的条带,大小分别是548 bp、409 bp和292 bp,最佳退火温度为53℃,引物浓度均为0.3μmol/L。该方法对CEV和KHV的检测限均为300 copies/μL,同时与其他水生动物病毒均无交叉反应。因此,本研究建立的方法可用于锦鲤样品中CEV和KHV的快速检测。

鲤浮肿病毒混合感染的监测与分析

在鲤浮肿病毒(Carp Edema virus,CEV)的流行病学监测时,经常发现在CEV感染病例中混合感染了鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)或锦鲤疱疹病毒(Koi Herpes Virus,KHV)的情况,为探讨这一现象,本研究对93份流行病学监测样品同时进行了CEV、SVCV和KHV的检测。结果发现CEV阳性50份,其中有5份样品存在混合感染,4份是CEV和SVCV的混合感染,1份是CEV和KHV的混合感染。混合感染病例占CEV感染病例的10%,且发生混合感染鱼的死亡率明显高于CEV单独感染。为进一步分析和验证混合感染情况,在安徽混合感染发病渔场取病鱼20尾,逐条检测,发现有5尾鱼混合感染CEV和SVCV,2尾鱼单独感染CEV,无单独感染SVCV的鱼。以上结果提示感染CEV的病鱼可混合感染SVCV或KHV,SVCV或KHV在CEV的致病过程中起协同作用。

2021年河北省鲤浮肿病调查报告

2021年对河北省鲤浮肿病发病及流行病学情况进行调查,根据调查结果,对比2017—2020年调查数据,分析得出,CEVD在河北省发病情况仍较严重,造成的经济损失依然较大;区域性发病仍具有连续性;因引种等原因造成点状发病有扩散趋势,应引起养殖单位高度关注。

云南锦鲤养殖场鲤浮肿病毒的鉴定及基因型分析

锦鲤睡眠病(Koi sleepy disease,KSD)是一种由鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)引起鲤科鱼类死亡的病毒性传染病,已经对世界鲤科鱼类养殖业造成危害。2016年,中国云南某锦鲤养殖场养殖的锦鲤出现以体表出血、眼睛凹陷、沉于池底昏睡为主要临床症状的疾病,发病水温为11℃~20℃,累计死亡率30%~50%。从该养殖场不同池塘采集两个样品,使用nested PCR和real-time PCR方法进行实验室诊断。结果表明,两个样品CEV检测结果均为阳性,发病锦鲤鳃和肾脏CEV病毒载量为250.02~1 332.94拷贝/250ng,鳃中CEV病毒载量约为肾脏的6~7倍。在排除寄生虫、细菌、SVCV和KHV感染后,推测CEV可能是引起此次云南锦鲤场发生疫情的病原,但还需回归感染实验做进一步验证。基于CEV P4a基因的遗传进化分析结果表明,此次从云南发病锦鲤检出的两个CEV毒株均属于IIa基因型,且与英国(R083株)和日本CEV毒株(CyPP-3)的遗传进化关系最近。