Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡

目的研究etoposide诱导视网膜神经节细胞RGC-5细胞死亡的分子机制。方法建立etoposide诱导的RGC-5细胞死亡模型,应用APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定RGC-5细胞的死亡方式,并进而利用Westernblot检测细胞内活化caspase-3及PARP-1的变化情况,并通过广谱caspase抑制剂间接证明是否有caspase依赖途径的激活。结果相对高浓度的etoposide(1～10μmol/L)可以迅速降低RGC-5细胞的活性并诱导死亡;APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定etoposide是以凋亡的方式诱导RGC-5细胞死亡;Westernblot显示etoposide诱导后的RGC-5细胞中caspase-3被激活并伴有PARP-1的降解片段出现;广谱caspase抑制剂Z-VAD-fmk可以保护etoposide诱导的RGC-5细胞,提高细胞活性。结论Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡。

鬼臼毒素纳米脂质载体通过非Caspase依赖途径诱导VK2/E6E7细胞凋亡机制的研究

目的:探讨鬼臼毒素纳米脂质载体(POD-NLC)诱导人永生化阴道上皮细胞(VK2/E6E7)凋亡的作用及机制。方法:取对数期生长VK2/E6E7细胞,分别加入POD-NLC和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同培养24小时。实验分为4组:A组:空白对照组;B组:0.25μg/mL POD-NLC+Caspase抑制剂组;C组:1μg/mL POD-NLC+Caspase抑制剂组;D组:空白NLC+Caspase抑制剂组。采用流式细胞仪检测ROS水平,qPCR检测AIF mRNA表达,蛋白印迹检测各组细胞AIF、cyt-C蛋白表达。结果:B组、C组均可以上调ROS、AIF、cyt-C水平,与A组及D组相比均有统计学差异(P值均<0.05);B组与C组AIF mRNA及AIF蛋白表达无统计学差异(P值均>0.05);ROS、cyt-C各组间比较均有统计学意义(P值均<0.05)。结论:鬼臼毒素纳米脂质载体可以通过非Caspase依赖途径诱导永生化阴道上皮细胞凋亡。

哈巴苷对急性脑缺血及线粒体介导的Caspase依赖性细胞凋亡信号通路的影响

目的探讨哈巴苷对急性脑缺血及线粒体介导的caspase依赖性细胞凋亡通路的影响。方法采用MCAO法建立小鼠急性脑缺血模型,造模后各组立即尾静脉注射(iv)哈巴苷(4、8、12 mg·kg^(-1))、依达拉奉(3.2 mg·kg^(-1)),模型组及假手术组同法给予等量生理盐水,0.1 mL·(10 g)^(-1)。造模6h后,观测小鼠神经功能评分、脑梗死体积及脑组织形态病理学变化;采用Western blot法测定各组脑组织线粒体中Cyt C及胞质中pro-caspase-3的含量。结果造模6 h后,哈巴苷各剂量组均能明显降低因缺血而增加的小鼠神经功能评分及脑梗死体积(P<0.01,P<0.05);均能不同程度减轻脑组织神经元核固缩、核溶解程度,改善脑组织因缺血造成的病理损伤;能明显上调脑组织线粒体中Cyt C及胞质中pro-caspase-3的表达。结论哈巴苷对急性脑缺血具有保护作用,其保护作用可能与抑制线粒体介导的caspase依赖性细胞凋亡信号通路相关。

白藜芦醇以Caspase依赖和非依赖两种方式导致Jurkat细胞死亡

应用形态学观察、流式细胞仪检测、Western印迹和DNA凝胶电泳等方法研究白藜芦醇对Jurkat细胞的作用。发现白藜芦醇处理组中细胞有皱缩、出泡、染色质边集等现象,但染色质浓缩呈散在团块状且不致密。细胞质结构疏松,线粒体肿胀,脊消失。少见凋亡小体。在白藜芦醇处理组,Western印迹可检测到弱的17kDacaspase-3条带,DNA凝胶电泳可以检测到梯状DNA和弥散条带;流式细胞仪在白藜芦醇处理组检测到大量PI单阳性细胞和少量膜联蛋白V单阳性细胞。Z-VAD-FMK干预后可以发现细胞死亡率降低,同时该组梯状DNA消失,但是大分子量弥散DNA条带依然可以检测到。结果表明白藜芦醇可以通过caspase依赖和非依赖途径导致Jurkat细胞死亡。此分子机制的明确将为白藜芦醇应用于临床白血病的治疗打下理论基础。

济阴颗粒对围绝经期综合征大鼠卵巢Caspase依赖性细胞凋亡通路的影响

目的探讨济阴颗粒干预围绝经期综合征的作用机制。方法雌性SPF级SD大鼠105只,随机选择10只正常大鼠为空白对照组,其余95只采用每日1次腹腔注射去氧乙烯基环己烯(VCD)溶液的方法造模,连续60 d。动情周期紊乱,血清雌二醇(E2)含量低于空白对照组最低值,卵泡雌激素(FSH)高于空白对照组最高值为造模成功。将造模成功大鼠随机分为6组,每组10只,分别为模型组、补佳乐组、坤宝丸组和济阴颗粒低、中、高剂量组。分组后,空白对照组与模型组给予蒸馏水,其他各组给予相应剂量药物,每日1次,连续30 d。采用荧光RT-PCR法检测卵巢组织Caspase-3,8,9 mRNA,Apaf-1 mRNA的表达。结果与空白对照组比较,模型组大鼠卵巢细胞中Caspase-3,8,9 mRNA,Apaf-1 mRNA的表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,济阴颗粒可显著降低卵巢细胞中Caspase-3,8,9 mRNA,Apaf-1 mRNA的表达。结论济阴颗粒可通过下调Caspase依赖性细胞凋亡通路的传导;抑制卵巢细胞凋亡,可能是其干预围绝经期综合征的作用机制之一。

亚低温对脑出血后非caspase酶依赖性凋亡通路的影响

目的观察亚低温对脑出血后非caspase依赖性通路中关键蛋白-凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)表达的影响。方法采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型。将大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和脑出血+亚低温组。采用免疫组化法检测大鼠脑出血后24、72h及7d时血肿周围组织中AIF的表达;以Tunnel染色法观察各时间点神经细胞凋亡的变化。结果与生理盐水组比较,脑出血组Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达高于生理盐水组(P<0.05)。同时,在脑出血组可以观察到Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达在24h逐渐增加,72h达高峰(P<0.01)。亚低温组Tunnel染色阳性细胞数及AIF表达在各个时间点均低于脑出血组(P<0.05)。结论亚低温可能通过抑制脑出血后非caspase依赖性通路中的关键蛋白AIF的表达来减少神经元凋亡,发挥脑保护作用。

替莫唑胺诱导大鼠脑胶质瘤C6细胞caspase非依赖的程序性死亡

目的观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞程序性死亡的诱导效应,并探讨可能的分子机制。方法观察不同浓度替莫唑胺在不同时间点处理大鼠脑胶质瘤大鼠脑胶质瘤C6细胞系,MTT法观察抑制率并筛选出最优的作用时间和作用浓度。应用400μg/ml替莫唑胺处理细胞24 h,通过HE染色、Hochest、Western blot、Tunnel、免疫组化观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞系的程序性死亡的诱导效应。结果 MTT法、HE染色、Hochest和Tunnel结果显示替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞具有凋亡诱导效应;免疫组化和Western blot结果显示促凋亡蛋白Bax表达水平上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达的下调。未发现主要的caspase蛋白的表达变化。结论替莫唑胺对脑胶质瘤C6细胞具有凋亡诱导效应,而这种效应可能是通过caspase非依赖途径完成的。

槲皮素诱导人鼻咽癌CNE2细胞发生Caspase非依赖性细胞凋亡的研究

目的探讨槲皮素抗鼻咽癌(NPC)CNE2细胞的机制。方法通过CCK-8实验检测槲皮素在CNE2中的抗肿瘤活性;流式细胞术Annexin V-FITC//PI双染法检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测槲皮素对CNE2细胞中凋亡标志蛋白、凋亡相关蛋白和凋亡诱导因子(AIF)以及细胞色素C(Cyt-C)的影响。结果槲皮素能抑制CNE2细胞生长、诱导细胞凋亡;Western blot结果显示,槲皮素能下调B淋巴细胞瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)和上调Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达;虽不能激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3),但能通过切割DNA修复酶(PARP),促进AIF和Cyt-C从线粒体释放,从而诱导NPC细胞凋亡。结论槲皮素诱导鼻咽癌CNE2细胞发生了Caspase非依赖性细胞凋亡。

哈巴苷对急性脑缺血小鼠神经细胞及caspase非依赖性凋亡通路的影响

目的研究哈巴苷对急性脑缺血小鼠海马神经细胞、线粒体功能及caspase非依赖性细胞凋亡通路的影响。方法采用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)复制小鼠急性脑缺血模型。造模后,各组分别立即尾静脉注射哈巴苷(4、8、12 mg·kg^(-1))、依达拉奉(3.2 mg·kg^(-1)),模型组及假手术组同法给予等量生理盐水(10 m L·kg^(-1))。造模6 h后,采用流式细胞术检测MCAO小鼠海马神经细胞凋亡率及线粒体膜电位;透射电镜观察MCAO小鼠海马神经细胞线粒体内外膜的清晰度、线粒体嵴的完整性、线粒体基质电子密度的高低变化及线粒体肿胀情况;采用Western blot法检测MCAO小鼠脑组织线粒体中AIF及Endo G的蛋白表达;采用q PCR法检测MCAO小鼠海马组织中AIF及Endo G mRNA的表达。结果造模6 h后,与假手术组相比,模型组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.01);神经细胞线粒体超微结构受损严重,线粒体结构松散,可见明显肿胀;脑组织线粒体中AIF及Endo G蛋白表达明显降低,线粒体AIF及Endo G蛋白释放增加(P<0.01);海马组织AIF及Endo G mRNA表达明显增加(P<0.01);与模型组相比,哈巴苷各剂量组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05,P<0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显升高(P<0.01);神经细胞线粒体超微结构明显改善;哈巴苷8、12 mg·kg^(-1)组小鼠脑组织线粒体中AIF及Endo G蛋白表达明显增加,线粒体AIF及Endo G蛋白释放减少(P<0.05,P<0.01),哈巴苷4 mg·kg^(-1)组小鼠脑组织线粒体中Endo G蛋白表达明显增加,线粒体Endo G蛋白释放明显减少(P<0.05);哈巴苷8、12 mg·kg^(-1)组小鼠海马组织AIF及Endo G mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论哈巴苷对急性脑缺血有保护作用,其机制可能与保护大脑神经细胞及线粒体生理活性,抑制caspase非依赖性细胞凋亡通路相关。

伏马菌素B1诱导Marc-145细胞caspase非依赖型程序性细胞死亡

[目的]以Marc-145细胞为模型,研究了伏马菌素B1能否导致细胞产生其他类型程序性细胞死亡。[方法]利用caspase抑制剂、蛋白合成抑制剂、非凋亡程序性细胞死亡necroptosis抑制剂及ROS抑制剂,分别抑制caspase活性、蛋白质合成、necroptosis和ROS,采用结晶紫染色和AnnexinV-FITC/PI双染分析这些抑制剂对伏马菌素B1诱导Marc-145细胞死亡的影响。[结果]caspase、necroptosis抑制剂和2种自由基抑制剂不能抑制伏马菌素B1诱导的Marc-145细胞死亡,但蛋白合成抑制剂则可以显著抑制伏马菌素B1诱导的Marc-145细胞死亡。[结论]伏马菌素B1所诱导的Marc-145细胞的死亡是一种受基因表达调控的程序性细胞死亡,但与caspase、ROS和nec-roptosis无关。

K562细胞Caspase非依赖程序性死亡的研究进展

Caspase非依赖性细胞程序性死亡(Caspase-independent cell death,CICD),是指在细胞程序性死亡中,Caspase不起主要作用,主要由PARP-1,Calpains,Bax及AIF 4种蛋白依次激活而启动,并具有不同于凋亡和坏死的生物学特点。近年来研究认为,通过CICD途径诱导K562细胞死亡不同于以往药物杀死白血病细胞的作用机制,有望成为一种新的药物作用靶点。本文综述了近年来对于CICD分子机制的最新认识,以及诱导K562细胞发生CICD的相关研究,以期为研究耐药肿瘤细胞药物作用新靶点提供参考。

颗粒酶A诱导Caspases非依赖性细胞死亡

颗粒酶A(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒颗粒中含量最多的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素(perforin)协同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)释放进入在杀伤细胞和靶细胞之间形成的免疫突触(immunological synapse),然后进入靶细胞的细胞浆,并在细胞核聚集,诱导一种caspases非依赖性细胞死亡。GzmA靶向作用于一种与内质网结合的特殊的复合体——SET复合体,其包含3种GzmA底物:核小体装配蛋白SET、DNA结合蛋白HMG-2、具有碱基切除修复作用的核酸内切酶Apel。SET复合体还含有一种抑癌蛋白pp32和一种具有脱氧核糖核酸酶(DNase)活性的NM23-H1。当GzmA作用于SET复合体时释放出NM23-H1并激活其DNase活性,也阻断了Apel对DNA损伤的修复作用,在DNA上形成单链的缺刻。这是一种新发现的由GzmA诱导的细胞凋亡途径。

济阴颗粒对绝经综合征大鼠卵巢Caspase非依赖性细胞凋亡通路的影响

目的探讨济阴颗粒治疗绝经综合征的可能作用机制。方法 105只大鼠随机选择10只作为空白对照组,其余95只采用腹腔注射去氧乙烯基环己烯溶液建造绝经综合征大鼠模型,将造模成功60只大鼠随机分为模型组、西药对照组、中药对照组和济阴颗粒低、中、高剂量组,每组10只。造模后空白对照组与模型组给予蒸馏水10ml/(kg·d)灌胃,济阴颗粒低、中、高剂量组分别给予济阴颗粒3.9、7.8、15.6 g济阴颗粒/(kg·d)灌胃,西药对照组给予戊酸雌二醇片0.105 mg/(g·d)灌胃,中药对照组给予坤宝丸10.5g/(kg·d)灌胃,每日灌胃1次,连续30天。免疫组织化学法检测卵巢细胞P53蛋白表达,荧光RT-PCR法检测卵巢细胞凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo-G)mRNA表达。结果与空白对照组比较,模型组卵巢细胞P53蛋白表达及AIF、Endo-G mRNA表达均升高(P<0.01),而济阴颗粒各剂量组均能降低卵巢细胞P53蛋白、AIF mRNA与Endo-G mRNA表达(P<0.01)。济阴颗粒低剂量组下调P53蛋白最显著,而高剂量组下调AIF mRNA作用最显著(P<0.01)。结论济阴颗粒可抑制Caspase非依赖性细胞凋亡通路,从而抑制卵巢细胞凋亡,可能是其治疗绝经综合征的作用机制之一。

Necrostain-1对缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元caspase非依赖性死亡的保护作用

目的研究低氧诱导因子（HIF）-1a是否介导缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元caspase非依赖性细胞死亡，Necrostain-1（Nec-1）能否抑制其表达起到保护作用。方法（1）原代皮质神经元培养14d，予caspase抑制剂z—VAD．fmk（z—VAD）预保护30min，同时分别予Nec-10．1，1，5，10，25，50μmoL／L，缺糖缺氧（OGD）2h、再灌注12h，通过LDH测细胞死亡情况；（2）予z-VAD作用后30min后，缺糖缺氧（OGD）2h再灌注0，2，6，12，24，48h，Westernblot检测HIF-1α蛋白表达情况，RT—PCR测HIF-1αRNA表达；（3）予z-VAD和Nee-125μmo[／L作用30min，OGD2h、再灌注12h后检测HIF-10t蛋白及RNA表达情况。结果（1）予Nec-15μmoL／L（6．97±0．06）后与未加Nec-1组（14．23±0．08）比较LDH水平明显下降（P〈0．05），Nec-125μmol／L（2．21±0．05）时LDH降至正常水平与正常组（1．03±0．03）比较，P〉0．05）；（2）缺糖缺氧2h再灌注后HIF-10α蛋白表达增加，再灌注2h后（0．57±0．09）与正常组（0．24±0．01）相比差异有统计学意义（P〈0．05），再灌注12h（0．91±0．08）达高峰，HIF-10LRNA表达无变化（P〉0．05）；（3）与未予Nec．1组（0．83±0．03）相比，Nec-1组（0．32±0．04）HIF-1α蛋白表达明显降低（P〈0．05），HIF-1αRNA表达无变化（P〉0．05）。结论HIF一1仅介导了缺氧缺氧诱导的原代皮质神经元caspase非依赖性死亡，Nec-1能够抑制HIF-1α的表达起到保护作用。

Caspase非依赖性细胞程序性死亡

一直以来细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡。后者是一种程序化的主动性细胞死亡,caspase在其中起着决定性作用。但是凋亡并非细胞程序性死亡的唯一形式。大量研究结果表明还存在caspase非依赖性的细胞程序性死亡,已被人们初步认识的有自体吞噬作用、paraptosis以及与线粒体相关的途径。这些caspase非依赖性的细胞程序性死亡途径在清除机体有害细胞和成分上起着非常重要的作用,并与发育和许多生理/病理现象密切相关。

星形孢菌素诱导小鼠T细胞中Caspase非依赖性细胞死亡方式的研究

目的:研究星形孢菌素(staurosporine,STS)诱导的小鼠T细胞中Caspase非依赖性细胞死亡方式,探讨T细胞死亡的分子机制。方法:在加入或不加Caspase抑制剂z-VAD-fmk(20μmol.L-1)情况下,检测STS(100 nmo.lL-1)刺激后小鼠T细胞的凋亡率,DNA ladder,线粒体膜电位变化以及凋亡相关蛋白AIF,细胞色素C和Bax等的变化。结果:STS诱导的小鼠T细胞凋亡中存在Caspase非依赖性细胞死亡方式,其DNA ladder改变与Caspase依赖性死亡方式不同,线粒体膜电位依然下降,AIF从线粒体转移到细胞质中要早于细胞色素C,且两者的转移需要Bax结合到线粒体上。结论:在STS诱导的小鼠T细胞死亡中,Caspase非依赖性死亡方式可能是Caspase依赖性死亡方式的替代途径,这对于维持T细胞的数量和保证免疫系统功能的正常发挥具有十分重要的意义。

神经细胞凋亡与脑缺血疾病

脑缺血疾病是现代人类健康和生命的主要杀手之一。近年研究发现,神经细胞凋亡是脑缺血疾病造成神经系统损伤的重要机制,神经细胞凋亡通路主要包括线粒体通路、死亡受体通路、PARP/AIF通路。基于神经细胞凋亡与脑缺血损伤关系的深入研究,抗凋亡治疗已经成为了治疗脑缺血疾病的重要途径。

吡虫啉对成年意大利蜜蜂脑神经细胞致凋亡作用

【目的】蜜蜂是重要的授粉昆虫,但一直受到新烟碱类杀虫剂(如吡虫啉)的危害,该类杀虫剂主要作用于蜜蜂脑神经细胞。本研究旨在明确吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica脑神经细胞致凋亡作用。【方法】利用亚致死剂量吡虫啉饲喂成年意大利蜜蜂,通过原位末端标记法(TUNEL)检测脑神经细胞的凋亡情况,利用免疫荧光法检测Caspase-1激活情况,通过透射电镜观察脑神经细胞的超微结构。【结果】在对选取的脑部7个部位进行总体观测后,摄入亚致死剂量的吡虫啉(9.90 ng/蜜蜂)诱导成年意蜂工蜂脑神经细胞凋亡率随时间递增而增加,在处理9 d和12 d时,处理组与空白对照组差异极显著(P<0.01);Caspase-1阳性细胞率也随时间递增而增加,在处理3,6,9和12 d时,处理组与空白对照组差异极显著(P<0.01)。凋亡率和Caspase-1阳性细胞率均表现出时间效应,且两者成正相关性。超微结构表明凋亡的神经细胞呈现凋亡和自噬双重特征,包括:细胞固缩、染色质浓缩、凋亡小体和自噬体出现;线粒体肿胀,有的被自噬泡包裹后进行线粒体自噬。【结论】本研究从细胞水平证实了亚致死剂量吡虫啉对成年意蜂工蜂脑神经细胞具有致凋亡作用,并且其凋亡途径与Caspase-1和细胞自噬有关,这为利用细胞凋亡法评价杀虫剂对非靶标生物的神经毒性提供一定的理论基础。

逆转录病毒载体导入重组ICAD和ICAD-DM对STS诱导大鼠C6细胞凋亡的影响

为了观察caspase依赖的脱氧核糖核酸酶(CAD)及其抑制剂ICAD对星形孢菌素(STS)诱导的C6细胞凋亡的影响,用含有ICAD/DFF45和caspase抗性的ICAD/DFF45突变体ICAD DM基因的复制缺陷型逆转录病毒载体转染包装细胞,并用产生的病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞株C6,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞.结果发现STS可显著诱导ICAD组的C6细胞出现DNA凋亡梯带,而ICAD DM组不出现DNA凋亡梯带;与ICAD DM组相比,STS对ICAD组MTT代谢的抑制作用更强(P<0.05);透射电镜观察显示ICAD DM组的细胞核形态改变弱于ICAD组.表明ICAD/DFF45的切割应在CAD/DFF40的激活中占主导地位,抑制ICAD/DFF45的切割并不能阻止凋亡的发生,但可延迟细胞死亡的速度,对染色质凝聚和核固缩的出现亦有一定抑制作用.

大鼠双侧肾切除后肝细胞的损伤方式

目的:观察大鼠双侧肾切除[非缺血性急性肾损伤(non ischemic acute kidney injury,NIAKI)]引起肝细胞损伤方式。方法:应用Western blot、免疫组织化学染色方法和光学、电子显微镜技术对双侧肾切除24 h后的大鼠肝脏进行了观察。结果:双侧肾切除24 h后的大鼠发生了急性肝功能受损,肝脏出现了大小不等坏死灶以及大面积区域性肝细胞的空泡样改变。光、电镜观察结果证明前者以细胞坏死为主,后者以细胞内出现大量空泡为主要表现。此外尚可见少许肝细胞凋亡的表现。Western blot的结果说明双侧肾切除后肝脏内多聚ADP核糖聚合酶(polyADP-ribose polymerase,PARP)-1过度激活,肿瘤坏死因子受体1和caspase-3蛋白表达均增强。免疫组化染色结果可见双侧肾切除后肝脏内出现了PARP-1阳性和caspase-3阳性的肝细胞。结论:形态学上NIAKI可引起肝细胞坏死,肝细胞空泡化与细胞凋亡,以前2种损伤为明显。从生物化学角度可以看出PARP-1介导的细胞死亡与caspase依赖的细胞死亡参与了NIAKI引起的急性肝损伤。