鬼臼毒素纳米脂质载体通过非Caspase依赖途径诱导VK2/E6E7细胞凋亡机制的研究

目的:探讨鬼臼毒素纳米脂质载体(POD-NLC)诱导人永生化阴道上皮细胞(VK2/E6E7)凋亡的作用及机制。方法:取对数期生长VK2/E6E7细胞,分别加入POD-NLC和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同培养24小时。实验分为4组:A组:空白对照组;B组:0.25μg/mL POD-NLC+Caspase抑制剂组;C组:1μg/mL POD-NLC+Caspase抑制剂组;D组:空白NLC+Caspase抑制剂组。采用流式细胞仪检测ROS水平,qPCR检测AIF mRNA表达,蛋白印迹检测各组细胞AIF、cyt-C蛋白表达。结果:B组、C组均可以上调ROS、AIF、cyt-C水平,与A组及D组相比均有统计学差异(P值均<0.05);B组与C组AIF mRNA及AIF蛋白表达无统计学差异(P值均>0.05);ROS、cyt-C各组间比较均有统计学意义(P值均<0.05)。结论:鬼臼毒素纳米脂质载体可以通过非Caspase依赖途径诱导永生化阴道上皮细胞凋亡。

替莫唑胺诱导大鼠脑胶质瘤C6细胞caspase非依赖的程序性死亡

目的观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞程序性死亡的诱导效应,并探讨可能的分子机制。方法观察不同浓度替莫唑胺在不同时间点处理大鼠脑胶质瘤大鼠脑胶质瘤C6细胞系,MTT法观察抑制率并筛选出最优的作用时间和作用浓度。应用400μg/ml替莫唑胺处理细胞24 h,通过HE染色、Hochest、Western blot、Tunnel、免疫组化观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞系的程序性死亡的诱导效应。结果 MTT法、HE染色、Hochest和Tunnel结果显示替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞具有凋亡诱导效应;免疫组化和Western blot结果显示促凋亡蛋白Bax表达水平上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达的下调。未发现主要的caspase蛋白的表达变化。结论替莫唑胺对脑胶质瘤C6细胞具有凋亡诱导效应,而这种效应可能是通过caspase非依赖途径完成的。

亚低温对脑出血后非caspase酶依赖性凋亡通路的影响

目的观察亚低温对脑出血后非caspase依赖性通路中关键蛋白-凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)表达的影响。方法采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型。将大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和脑出血+亚低温组。采用免疫组化法检测大鼠脑出血后24、72h及7d时血肿周围组织中AIF的表达;以Tunnel染色法观察各时间点神经细胞凋亡的变化。结果与生理盐水组比较,脑出血组Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达高于生理盐水组(P<0.05)。同时,在脑出血组可以观察到Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达在24h逐渐增加,72h达高峰(P<0.01)。亚低温组Tunnel染色阳性细胞数及AIF表达在各个时间点均低于脑出血组(P<0.05)。结论亚低温可能通过抑制脑出血后非caspase依赖性通路中的关键蛋白AIF的表达来减少神经元凋亡,发挥脑保护作用。

白藜芦醇以Caspase依赖和非依赖两种方式导致Jurkat细胞死亡

应用形态学观察、流式细胞仪检测、Western印迹和DNA凝胶电泳等方法研究白藜芦醇对Jurkat细胞的作用。发现白藜芦醇处理组中细胞有皱缩、出泡、染色质边集等现象,但染色质浓缩呈散在团块状且不致密。细胞质结构疏松,线粒体肿胀,脊消失。少见凋亡小体。在白藜芦醇处理组,Western印迹可检测到弱的17kDacaspase-3条带,DNA凝胶电泳可以检测到梯状DNA和弥散条带;流式细胞仪在白藜芦醇处理组检测到大量PI单阳性细胞和少量膜联蛋白V单阳性细胞。Z-VAD-FMK干预后可以发现细胞死亡率降低,同时该组梯状DNA消失,但是大分子量弥散DNA条带依然可以检测到。结果表明白藜芦醇可以通过caspase依赖和非依赖途径导致Jurkat细胞死亡。此分子机制的明确将为白藜芦醇应用于临床白血病的治疗打下理论基础。

Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡

目的研究etoposide诱导视网膜神经节细胞RGC-5细胞死亡的分子机制。方法建立etoposide诱导的RGC-5细胞死亡模型,应用APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定RGC-5细胞的死亡方式,并进而利用Westernblot检测细胞内活化caspase-3及PARP-1的变化情况,并通过广谱caspase抑制剂间接证明是否有caspase依赖途径的激活。结果相对高浓度的etoposide(1～10μmol/L)可以迅速降低RGC-5细胞的活性并诱导死亡;APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定etoposide是以凋亡的方式诱导RGC-5细胞死亡;Westernblot显示etoposide诱导后的RGC-5细胞中caspase-3被激活并伴有PARP-1的降解片段出现;广谱caspase抑制剂Z-VAD-fmk可以保护etoposide诱导的RGC-5细胞,提高细胞活性。结论Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡。

Caspase非依赖性细胞死亡的研究进展

细胞凋亡是一种生理性细胞死亡机制,它是由多基因调控的一种细胞的主动的自杀性过程。一般认为它是由蛋白酶caspases通过两种途径激活的。但是,近年来研究发现除caspases引起的细胞凋亡外,还有caspases非依赖性的细胞死亡形式存在,包括细胞的自我吞噬作用、细胞蛋白酶体的降解和线粒体途径。这些途径无论是在试验的条件下还是在生理或病理的情况下都可以观察到。目前认为凋亡诱导因子(AIF)在caspases非依赖性的细胞死亡中起关键作用。

OXSR1活性对p53依赖和非依赖途径介导的犬肾细胞凋亡的影响

【目的】研究氧化应激反应激酶1(oxidative stress-responsive 1,OXSR1)在犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)凋亡中的作用,为深入理解MDCK凋亡通路及研究以OXSR1基因为靶向的MDCK凋亡的干预疗法提供参考。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在MDCK-Cas9细胞上构建OXSR1基因敲除细胞系,在OXSR1基因敲除细胞中转入OXSR1基因回补与失活质粒以构建OXSR1基因回补与失活细胞系。以刺激剂MMC、JNJ-26854165、Rotenone分别刺激野生型细胞与OXSR1基因敲除、回补、失活细胞,通过流式细胞术检测激活的p53依赖和非依赖途径、ROS信号通路介导的细胞凋亡,并通过实时荧光定量PCR检测相关凋亡基因的表达情况。【结果】靶序列出现明显的Indel特征,证实OXSR1基因敲除细胞系构建成功。Western blotting检测显示,OXSR1基因回补与失活细胞系构建成功。流式细胞术发现,刺激剂MMC、JNJ-26854165、Rotenone均能诱导细胞发生不同程度的凋亡,其中在MMC和Rotenone刺激下,OXSR1基因敲除细胞凋亡率极显著或显著低于野生型细胞和OXSR1基因回补细胞(P<0.01;P<0.05),与OXSR1基因失活细胞无显著差别(P>0.05);在JNJ-26854165刺激下,OXSR1基因敲除细胞凋亡率极显著或显著低于野生型细胞、OXSR1基因回补和失活细胞(P<0.01;P<0.05)。实时荧光定量PCR检测发现,当MMC和Rotenone刺激细胞时,OXSR1基因敲除细胞的BCL-XL基因表达量极显著或显著高于野生型细胞和OXSR1基因回补细胞(P<0.01;P<0.05),与OXSR1基因失活细胞无明显差别(P>0.05);当JNJ-26854165刺激细胞时,OXSR1基因敲除细胞的BCL-XL基因表达量极显著高于野生型细胞、OXSR1基因回补与失活细胞(P<0.01),NOXA基因表达量极显著低于野生型细胞、OXSR1基因回补与失活细胞(P<0.01)。【结论】OXSR1基因及其激酶活性可调节MMC、JNJ-26854165、Rotenone刺激MDCK时BCL-XL基因转录,影响p53依赖和非依赖途径以及ROS途径介导的细胞凋亡。

老年退行性疾病中Caspase非依赖性细胞凋亡机制研究

细胞凋亡是一种程序化的主动的细胞死亡过程。一般认为它是由蛋白酶Caspase通过两种途径激活的。但最近的研究发现除了Caspase引起的凋亡外,还有Caspase非依赖性的细胞死亡形式存在。本文综述了近年来有关Caspase非依赖性细胞凋亡调控的研究进展。

哈巴苷对急性脑缺血小鼠神经细胞及caspase非依赖性凋亡通路的影响

目的研究哈巴苷对急性脑缺血小鼠海马神经细胞、线粒体功能及caspase非依赖性细胞凋亡通路的影响。方法采用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)复制小鼠急性脑缺血模型。造模后,各组分别立即尾静脉注射哈巴苷(4、8、12 mg·kg^(-1))、依达拉奉(3.2 mg·kg^(-1)),模型组及假手术组同法给予等量生理盐水(10 m L·kg^(-1))。造模6 h后,采用流式细胞术检测MCAO小鼠海马神经细胞凋亡率及线粒体膜电位;透射电镜观察MCAO小鼠海马神经细胞线粒体内外膜的清晰度、线粒体嵴的完整性、线粒体基质电子密度的高低变化及线粒体肿胀情况;采用Western blot法检测MCAO小鼠脑组织线粒体中AIF及Endo G的蛋白表达;采用q PCR法检测MCAO小鼠海马组织中AIF及Endo G mRNA的表达。结果造模6 h后,与假手术组相比,模型组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.01);神经细胞线粒体超微结构受损严重,线粒体结构松散,可见明显肿胀;脑组织线粒体中AIF及Endo G蛋白表达明显降低,线粒体AIF及Endo G蛋白释放增加(P<0.01);海马组织AIF及Endo G mRNA表达明显增加(P<0.01);与模型组相比,哈巴苷各剂量组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05,P<0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显升高(P<0.01);神经细胞线粒体超微结构明显改善;哈巴苷8、12 mg·kg^(-1)组小鼠脑组织线粒体中AIF及Endo G蛋白表达明显增加,线粒体AIF及Endo G蛋白释放减少(P<0.05,P<0.01),哈巴苷4 mg·kg^(-1)组小鼠脑组织线粒体中Endo G蛋白表达明显增加,线粒体Endo G蛋白释放明显减少(P<0.05);哈巴苷8、12 mg·kg^(-1)组小鼠海马组织AIF及Endo G mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论哈巴苷对急性脑缺血有保护作用,其机制可能与保护大脑神经细胞及线粒体生理活性,抑制caspase非依赖性细胞凋亡通路相关。

伏马菌素B1诱导Marc-145细胞caspase非依赖型程序性细胞死亡

[目的]以Marc-145细胞为模型,研究了伏马菌素B1能否导致细胞产生其他类型程序性细胞死亡。[方法]利用caspase抑制剂、蛋白合成抑制剂、非凋亡程序性细胞死亡necroptosis抑制剂及ROS抑制剂,分别抑制caspase活性、蛋白质合成、necroptosis和ROS,采用结晶紫染色和AnnexinV-FITC/PI双染分析这些抑制剂对伏马菌素B1诱导Marc-145细胞死亡的影响。[结果]caspase、necroptosis抑制剂和2种自由基抑制剂不能抑制伏马菌素B1诱导的Marc-145细胞死亡,但蛋白合成抑制剂则可以显著抑制伏马菌素B1诱导的Marc-145细胞死亡。[结论]伏马菌素B1所诱导的Marc-145细胞的死亡是一种受基因表达调控的程序性细胞死亡,但与caspase、ROS和nec-roptosis无关。

槲皮素诱导人鼻咽癌CNE2细胞发生Caspase非依赖性细胞凋亡的研究

目的探讨槲皮素抗鼻咽癌(NPC)CNE2细胞的机制。方法通过CCK-8实验检测槲皮素在CNE2中的抗肿瘤活性;流式细胞术Annexin V-FITC//PI双染法检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测槲皮素对CNE2细胞中凋亡标志蛋白、凋亡相关蛋白和凋亡诱导因子(AIF)以及细胞色素C(Cyt-C)的影响。结果槲皮素能抑制CNE2细胞生长、诱导细胞凋亡;Western blot结果显示,槲皮素能下调B淋巴细胞瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)和上调Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达;虽不能激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3),但能通过切割DNA修复酶(PARP),促进AIF和Cyt-C从线粒体释放,从而诱导NPC细胞凋亡。结论槲皮素诱导鼻咽癌CNE2细胞发生了Caspase非依赖性细胞凋亡。

K562细胞Caspase非依赖程序性死亡的研究进展

Caspase非依赖性细胞程序性死亡(Caspase-independent cell death,CICD),是指在细胞程序性死亡中,Caspase不起主要作用,主要由PARP-1,Calpains,Bax及AIF 4种蛋白依次激活而启动,并具有不同于凋亡和坏死的生物学特点。近年来研究认为,通过CICD途径诱导K562细胞死亡不同于以往药物杀死白血病细胞的作用机制,有望成为一种新的药物作用靶点。本文综述了近年来对于CICD分子机制的最新认识,以及诱导K562细胞发生CICD的相关研究,以期为研究耐药肿瘤细胞药物作用新靶点提供参考。

非Caspase依赖细胞凋亡因子对脑缺血/再灌注损伤的作用研究

目的缺血性脑卒中后缺血/再灌注损伤是其主要病理生理改变,而非Caspase依赖细胞凋亡通路在缺血半暗带损伤级联反应中发挥重要作用。通过一系列神经细胞凋亡因子之间的相互作用及调控级联反应,启动细胞凋亡。非Caspase依赖细胞凋亡信号通路是脑缺血/再灌注损伤研究的新观点。本文就相关非Caspase依赖细胞凋亡因子及调控机制对脑缺血/再灌注损伤的影响做一综述。

颗粒酶A诱导Caspases非依赖性细胞死亡

颗粒酶A(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒颗粒中含量最多的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素(perforin)协同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)释放进入在杀伤细胞和靶细胞之间形成的免疫突触(immunological synapse),然后进入靶细胞的细胞浆,并在细胞核聚集,诱导一种caspases非依赖性细胞死亡。GzmA靶向作用于一种与内质网结合的特殊的复合体——SET复合体,其包含3种GzmA底物:核小体装配蛋白SET、DNA结合蛋白HMG-2、具有碱基切除修复作用的核酸内切酶Apel。SET复合体还含有一种抑癌蛋白pp32和一种具有脱氧核糖核酸酶(DNase)活性的NM23-H1。当GzmA作用于SET复合体时释放出NM23-H1并激活其DNase活性,也阻断了Apel对DNA损伤的修复作用,在DNA上形成单链的缺刻。这是一种新发现的由GzmA诱导的细胞凋亡途径。

TGF-β1的非Smad4依赖性途径与胰腺癌细胞耐药性的相关性

目的:研究TGFβ1的非Smad4依赖性途径与胰腺癌耐药性之间的相关性。方法:采用MTT法观察Smad4纯合性缺失的胰腺癌细胞株BxPC3对不同化疗药物(5Fu、健择、草酸铂、顺铂、开普拓和表柔比星)的敏感性差异;MTT法观察转染了pcDNA3TGFβ1质粒的BxPC3细胞及5ng/ml和10ng/mlTGFβ1作用后的BxPC3细胞对顺铂敏感性的影响、蛋白免疫印迹检测TGFβ1作用后p170的改变情况。结果:BxPC3细胞对健择和表柔比星的敏感性最差,5Fu、开普拓和草酸铂次之,顺铂作用最强。转染了TGFβ1全长cDNA质粒的BxPC3细胞对顺铂的耐受能力增强;给予TGFβ1细胞外刺激后,也能增加细胞对顺铂的耐受能力。蛋白免疫印迹表明TGFβ1能增加p170(mdr1)的表达。结论:TGFβ1的非Smad4依赖性途径能通过上调p170的表达而增加肿瘤细胞的耐药性。

低剂量吡格列酮通过非过氧化物酶体增殖物激活受体依赖途径保护创伤性脑损伤

目的探讨低剂量吡格列酮(Pio)是否通过非过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)依赖途径对创伤性脑损伤发挥神经保护作用。方法 6周龄SD雄性大鼠30只分为假致伤组、TBI组、PPARγ拮抗剂T0070907 1.0 mg/kg组、低剂量Pio 1.0 mg/kg组、T0070907 1.0 mg/kg+Pio 1.0 mg/kg组、大剂量Pio 10.0 mg/kg组,除假致伤组外均作Feeney自由落体重物锤打击。采用HE染色、尼氏染色及TUNEL染色观察实验大鼠脑组织细胞损伤、尼氏体脱失及神经细胞凋亡程度,定量PCR技术检测PPARγmRNA表达水平。结果 1低剂量吡格列酮能减轻创伤性脑损伤后细胞损伤,Pio 1.0组、Pio 10.0组细胞损伤率明显低于T0070907组和TBI组(P<0.05),Pio 1.0组与Pio 10.0组细胞损伤率无统计学差异(P>0.05);2低剂量吡格列酮能减轻创伤性脑损伤后尼氏体脱失,Pio 1.0组、Pio 10.0组尼氏体脱失率明显低于T0070907组和TBI组(P<0.05),Pio 1.0组与Pio 10.0组尼氏体脱失率无统计学差异(P>0.05);3低剂量吡格列酮能减轻创伤性脑损伤后细胞凋亡,Pio 1.0组、Pio 10.0组凋亡细胞数明显少于T0070907组和TBI组(P<0.05),Pio 1.0组与Pio 10.0组凋亡细胞数无统计学差异(P>0.05);4大剂量Pio 10.0组PPARγmRNA表达最多,与低剂量Pio 1.0组有统计学差异(P<0.05)。结论低剂量吡格列酮可通过非PPARγ依赖途径对创伤性脑损伤发挥神经保护作用。

谷子转录因子SiNF-YA5通过ABA非依赖途径提高转基因拟南芥耐盐性

核转录因子Y（nuclear transcription factor Y,NF-Y）类转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应基因表达调控中发挥重要的作用,NF-Y由3种亚基（NF-YA、NF-YB、NF-YC）组成。本研究从抗逆性强的谷子品种龙谷25中克隆1个新的NF-Y类转录因子基因Si NF-YA5。该基因序列为924 bp,编码307个氨基酸,分子量为33.76 k D,等电点为9.19。Si NF-YA5在149~210位氨基酸之间含有CBF保守结构域。亚细胞定位分析表明,Si NF-YA5定位于细胞膜和细胞核。基因功能分析显示,在不同浓度高盐处理下,和野生型拟南芥（WT）相比Si NF-YA5转基因拟南芥种子萌发率更高;苗期Si NF-YA5转基因拟南芥根表面积和植株鲜重显著高于WT,证明过表达Si NF-YA5基因可以显著提高植物耐盐性。基因表达分析结果显示,在Si NF-YA5转基因拟南芥中参与盐胁迫响应的基因NHX1和LEA7的表达量明显高于WT。另一方面,Si NF-YA5转基因拟南芥与WT相比对于ABA的敏感性差异不显著,以上结果证明Si NF-YA5主要通过ABA非依赖途径提高转基因植物对高盐胁迫的耐性。

塞来昔布介导非环氧合酶2依赖的细胞核因子κB抗肿瘤途径的研究进展

因循证医学(EMB)证明长期服用非甾体类抗炎药(NSAIDs)可以降低消化道肿瘤发病率,故而NSAIDs的使用备受关注。塞来昔布作为NSAIDs中的高选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂,其较传统NSAIDs具有毒副作用少、安全性高等特点,被广泛应用于抗肿瘤领域的研究。然而塞来昔布在一些不表达COX-2的肿瘤细胞株中亦能发挥有效的抗肿瘤作用。为此,本文就塞来昔布介导的COX-2非依赖的核因子κB(NF-κB)抗肿瘤途径的研究进行综述,通过分析塞来昔布在用于肿瘤细胞实验中介导NF-κB途径引起的多种细胞学效应,更深入、全面地揭示塞来昔布抗肿瘤机制。

非替代疗法对不同吸毒途径患者疗效比较

目的 比较非替代疗法对不同吸毒途径海洛因依赖患者的临床疗效。方法 对 76例海洛因依赖患者用抗抑郁、抗焦虑、抗精神病药、脱水药和对症支持等非替代综合疗法治疗 ,观察疗效差异。结果 患者躯体依赖症状 3～ 1 5日消失 ,不同吸毒途径海洛因依赖患者躯体依赖症状消失时间、戒断后出现意识障碍比例 ,无明显差异。结论 非替代综合疗法对吸毒不同途径海洛因依赖患者均有较好疗效 。

AMID, an AIF homologous protein, induces caspases-independent apop-tosis

AIF is a mitochondrial flavoprotein that triggers caspase-independent apoptosis. We cloned and characterized a novel AIF homologous molecule designated as AMID (AIF-homologous Mitochondrion-associated Inducer of Death. AMID lacks a mitochondrial localization sequence but shares significant homology with AIF and NADH-oxidoreductases from bacteria to mammalian species. Immunofluorescent staining and biochemical experiments indicated that AMID was co-localized with mitochondria. Overexpression of