Identification of EST–SSRs and molecular diversity analysis in Mentha piperita

EST sequences of Mentha piperita available in the public domain(NCBI) were exploited to develop SSR markers. A total of 1316 ESTs were assembled into 155 contigs and 653 singletons and of these, 110 sequences were found to contain 130 SSRs, with a frequency of1 SSR/3.4 kb. Dinucleotide repeat SSRs were most frequent(72.3%) with the AG/CT(43.8%)repeat motif followed by AT/AT(16.2%). Primers were successfully designed for 68SSR-containing sequences(62.0%). The 68 primers amplified 13 accessions of M. piperita and 54 produced clear amplicons of the expected size. Of these 54, 33(61%) were found to be polymorphic among M. piperita accessions, showing from 2 to 4 alleles with an average of2.33 alleles/SSR, and the polymorphic information content(PIC) value varied between 0.13 and 0.51(average 0.25). All the amplified SSRs showed transferability among four different species of Mentha, with a highest in Mentha arvensis(87.0%) and minimum in Mentha citrata(37.0%). The newly developed SSRs markers were found to be useful for diversity analysis, as they successfully differentiated among species and accessions of Mentha.

白菜EST-SSR信息分析与标记的建立

数量迅速增加的EST为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源。本研究对4584条白菜EST进行了搜索,共检索出474个SSR,检出率为10·3%,包括40种重复基元。其中二核苷酸和三核苷酸重复单元的EST-SSR占主导地位,二者出现的频率基本相近,占总SSR的近83%;其它重复类型所占比例均不足5%。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复类型的71·5%和37·5%。设计了15对EST-SSR引物,在合适的PCR反应体系下,以构建EST的白菜自交系A的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现15对EST-SSR引物都能扩增出产物。进一步用这些可扩增的引物对28个白菜品种进行PCR扩增,发现7对引物显示多态性,占引物总数的46·7%。此结果表明,根据EST建立EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径。

茶树EST-SSR的信息分析与标记建立

在1589条茶树EST中,共发掘出了281个EST-SSR,分布于246条EST中,出现频率是17.68%,平均长度为33.06bp,平均分布频率是1/2.61kb。在茶树EST-SSR中,二核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元类型是AG/CT重复。设计了19对SSR引物,在对引物、dNTP、MgCl2的浓度及退火温度等参数进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。以衍生绝大多数EST-SSR的龙井43DNA为模板,对引物进行了筛选,有16对引物显示扩增,可用率为84.2%;进一步在10个茶树品种中进行多态性测试,显现出多态性的引物占可扩增引物的62.5%。本文研究结果证明了根据茶树EST建立SSR标记是有效、可行的。

核桃EST-SSR信息分析与标记的初步建立

利用生物信息学方法,从dbEST数据库用SSRHunter软件对4 500条核桃EST序列进行搜索,发现462个SSR分布于399条EST序列中,EST-SSR出现频率10.27%,平均每5.65 kb EST出现一个SSR。核桃二核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元,分别占总SSR的49.57%和27.27%。核桃二核苷酸EST-SSR的优势类型为AG,其次为AT,分别占二核苷酸SSR的67.25%和28.38%。核桃三核苷酸EST-SSR的优势重复基元为AAG,其次为ACC、AAT、AGG,分别占三核苷酸SSR的25.40%、21.43%、16.67%和11.11%。用Primer Primer 5.0软件设计了11对引物,对核桃属5个样品进行PCR扩增,10对引物有扩增产物,引物有效扩增率90.9%,其中7对引物有多态性,多态性引物占可扩增引物的70%。表明,利用核桃EST序列开发EST-SSR标记是可行的。

西洋参EST资源的SSR信息分析

为了进一步利用现有的西洋参EST-SSR资源,从NCBI公共数据库中下载了4988条西洋参EST,全长为2616.042 kb。含SSR的EST序列313条,共349个SSR,平均每相隔7.5 kb出现1个SSR。SSR出现的频率和平均长度分别为7.00%和24.4 bp。在1-6 bp的重复基元中,三核苷酸重复基元出现频率最高,为34.09%;其次为二核苷酸重复基元和单核苷酸重复基元,分别为32.09%和21.78%。出现最多的重复基元为A/T（20.9%）,其次是AT/TA（16.9%）。结果显示,西洋参的EST数据库中SSR序列出现频率较高,类型较丰富、多态性较高,根据西洋参EST建立其EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径。

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)转录组EST-SSR位点的信息分析及其多态性检测

本研究采用高通量测序技术进行了翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)转录组学研究,并扩增分析了EST-SSR分子标记的多态性,以期保护翘嘴鳜种质资源及良种选育,发掘其功能性SSR分子标记。结果表明,在翘嘴鳜转录组测序得到的51245条unigenes中共检测出14094个EST-SSR位点,分布于35285条Unigenes中,出现频率为27.51%。翘嘴鳜转录组EST-SSR位点的序列总长度达到195086bp,EST-SSR位点长度分布从10—25个碱基不等,平均长度13bp;翘嘴鳜转录组EST-SSR位点共有90种重复基元;其中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的30.62%和14.23%,且GT/AC、AAG/CCT分别占总SSR的32.12%和6.36%。随机选取100对经济性状相关EST-SSR引物的扩增产物中有24.7%表现为多态性,可作为功能性SSR分子标记开发。

木薯种质库遗传多样性的EST-SSR标记

采用49对表达序列标签-微卫星标记(EST-SSR)引物对76份木薯材料(39份新引进材料和37份原始材料)进行遗传多样性分析,共获得135个多态性位点,每对引物检测等位基因数为1～4个,平均为2.75个;扩增产物的片段大小范围在250～750bp之间。根据遗传相似系数的聚类分析将所有材料分为5组,即A、B、C、D和E组,其中A、C、D、E4个组均为新引进种质,B组以0.6250为阈值,又将其分为5个亚组,其中B1、B2除了个别外,均为新引进种质,B2来自非洲,而B3、B4和B5主要为原有种质和育种品系。同时估算了分组后组间的遗传多样性指数,发现其平均遗传多样性指数达到0.4465。比较原来多样性分析结果,说明新引进这一批国外种质具有新的遗传类型,丰富了我国木薯种质资源库。

牙鲆EST资源的SSR信息分析

应用生物信息学方法,对牙鲆EST-SSRs的分布频率及碱基重复特点进行了归纳与分析。结果表明,5 927条牙鲆非冗余EST序列通过在线搜索共检索出471个SSRs,分布于390条EST中,出现频率为7.95%,平均分布距离为7.9 kb。包括了112种重复基元,其中二核苷酸重复基元占主导地位,占总SSR的59.02%。AC是二核苷酸中的优势基元,占二核苷酸重复类型的16.91%。三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元分布比较分散,三核苷酸重复基元中GAG数量最多,但仅占三核苷酸重复类型的7.26%。研究结果为牙鲆EST-SSR标记的开发及应用奠定了理论基础。

基于EST-SSR的木薯分子标记遗传连锁图谱的构建

此实验以木薯推广品种KU50为母本,SC124为父本通过杂交得到包含240个单株的F1分离群体,利用300对EST-SSR引物,20对SSR和20对SRAP引物组合对亲本和部分群体株系进行多态性分子标记筛选,共获得具有多态性的引物110对。在此基础上,利用这110对多态性引物对该F1群体进行分子标记的多态性分析,共获得269个多态性标记。利用JoinMap3.0软件对这269个多态性标记进行分组和遗传图谱构建,最后获得了一张包含140个标记的木薯分子遗传连锁图谱,其中EST-SSR标记111个,SSR标记22个,SRAP标记7个;共21个连锁群,其中连锁群1和3(LG1、LG3)上的标记位点最多(15个),LG21标记位点最少(2个)。此遗传连锁图谱的总长度为1314.775cM,单个连锁群最长为132.904cM(LG3),最短为0.431cM(LG19),标记间平均长度9.391cM。

油菜EST-SSR标记的建立

在油菜17987条非冗余EST中,共发掘出了2083个EST-SSR,分布于2443条EST中,发生频率是13.58%,平均分布距离为4.34kb。在油菜EST-SSR中,二、三核苷酸重复是主要的重复类型,二者出现的频率相近,占总SSR的89.05%。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复类型的84.31%和37.71%。进一步设计了23对SSR引物,通过梯度PCR试验确定了各引物的适宜退火温度,并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶银染对这些引物在10个油菜品种中的扩增情况和多态性进行了检测。有21对引物显示扩增,引物可用率为91.30%;有12对引物显现出多态性,占可扩增引物的57.14%。本研究结果证明根据油菜EST建立SSR标记是有效、可行的。

草棉EST-SSRs的遗传评价

根据GenBank中公布的247条草棉EST序列,搜索SSR并进行引物设计。其中的25条序列含有27个SSR,1～6碱基重复类型都存在,二碱基和三碱基重复的频率较高。为了明确在A、D和AD基因组中的可转移性,依据25条序列共设计25对EST-SSR引物,其中22对引物扩增出清晰可辨的DNA条带,产生92个多态性片段,平均每对引物产生3.64个多态性片段。引物的多态性信息含量(PIC)在0.49～0.91之间,平均为0.81。6对引物在BC1种间作图群体[(鄂棉22×Pima3-79)×鄂棉22]中表现多态性,产生7个多态性位点,其中5个为共显性,2个为显性。除HAU230b标记在BC1分离群体中不符合孟德尔式分离比例,其余引物表现正常分离。6个位点被整合到陆地棉和海岛棉种间BC1遗传连锁图谱上的6条染色体:有4个位于A亚基因组的4条染色体上(Chr.6、10、11和12),2个位于D亚基因组的2条染色体(Chr.19和20)。

木薯EST资源的SSR信息分析

为了进一步利用现有木薯EST-SSR资源,笔者从NCBI公共数据库下载了38411条木薯EST,去除低质量的和冗余的的序列后,得到全长为4.16×103kb的无冗余序列5401条。在无冗余序列中发现含有SSR的EST序列595条,共691个SSR,平均相隔6.02kb出现一个SSR。这些SSR的出现频率和平均长度分别是11.02%和18.89bp。在1～6bp的重复基元中,二核苷酸重复基元出现频率最高(36.03%),其次是三核苷酸重复基元(31.84%)、单核苷酸重复基元(30.10%)。出现较多的重复基元是A/T(29.23%),其次是AG/CT(24.75%)。结果说明,木薯的EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值。

菊苣EST-SSR分子标记开发及通用性分析

为了开发菊苣(Cichorium intybus)简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)分子标记,采用菊苣表达序列标签(Expressed sequence tags,EST)序列设计EST-SSR引物,并验证引物的有效性和通用性。结果表明:菊苣EST序列中共搜索到648个SSR位点,146种重复基序,SSR出现频率为1.61%;三核苷酸重复类型最多(46.45%),TC/GA基序出现频率最高(14.35%);152对EST-SSR引物在菊苣中的有效扩增率和多态率分别为78.29%和57.24%。其中37对引物在31份莴苣亚族(Lactucinae Less.)材料中的扩增转移率为86.05%,遗传多样性分析显示不同种间存在明显的遗传分化,聚类结果与材料的地理来源有较高相关性。综上所述,基于菊苣EST序列开发的SSR引物可用于菊苣及其近缘属种遗传多样性分析及种间鉴定,为菊苣族(Lactuceae Cass.)种质资源评价、系统进化研究及分子标记辅助育种奠定了重要基础。

西瓜EST资源的SSR信息分析

对5034条西瓜无冗余EST序列进行了搜索,共检索出347个SSR,检出率为6.89%,平均分布距离为7.49kb。包括91种重复基元,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占主导地位,分别占总SSR的39.48%和46.68%。AT是二核苷酸中的优势基元,占二核苷酸重复类型的23.35%。三核苷酸重复基元分布比较分散,优势基元GAA仅占三核苷酸重复类型的8.64%。理论上表明这些EST-SSR具有较高的可用性。

三年桐EST-SSR标记的开发与种质遗传多样性分析

以三年桐品种对年桐发育中的种子为材料,构建c DNA文库,获得3202个原始EST序列,经过去除冗余和低质量序列后,获得1047条非冗余单一序列,利用MISA软件从其中的173个非冗余EST序列中搜索得到212个SSR位点。其中,二核苷酸重复类型为主导（68.39%）,其次是三核苷酸重复类型（25.94%）,其优势基元为AG/CT（43.87%）、AT/AT（19.34%）和AGC/GCT（5.66%）。针对可设计引物的68个序列进行EST-SSR引物设计,结合PCR扩增和数据分析,鉴定出14对多态性标记,用该14对引物对169份三年桐种质资源进行遗传多样性检测,共得到41个等位基因（Na）,平均每对引物扩增出2.93个等位基因,期望杂合度（He）变幅为0.08~0.63,平均值为0.33,多态性信息含量（PIC）变幅为0.08~0.56,平均值为0.3,表明14对EST-SSR标记多态性较高,能较好地反映三年桐种质的遗传多样性。三年桐种质资源按群体进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析,群体间的相似度变幅为0.9604~0.9986,遗传距离变幅为0.0022~0.0404,表明三年桐群体间的遗传多样性相对较低,亲缘关系较近。对169份三年桐种质资源个体进行聚类分析,结果显示不同地理种源的遗传关系缺乏明显的地理结构。

丹参EST序列中SSR信息的分析及分子标记的建立

本文对从NCBI下载的鼠尾草属11747条EST序列(其中,丹参10228条)进行分析,搜索到含SSR的序列1911条,共含有SSR2156个,出现频率为18.35%。在丹参EST-SSR中,核苷酸重复基元种类共77种。单核苷酸重复最多,出现频率为10.45%,二、三核苷酸的出现频率为3.72%、4.40%。三核苷酸重复中ACG/CTG为主要类型,占27.3%。共设计引物143对,合成13对(其中,丹参6对,Salvia fruticosa7对),在对引物、dNTP、MgCl2进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。引物筛选发现7对引物(丹参6对,S.fruticosa1对)对丹参基因组DNA均有良好的扩增,并对11个不同产地丹参样品进行扩增均呈现良好的多态性。本研究结果证明根据丹参EST资源建立丹参EST-SSR标记是可行的。

黄瓜EST-SSR位点信息

从NCBI网站下载6344条黄瓜EST，通过前处理得到全长为2．91×10^6bp的无冗余EST6033条。利用SSRHunt-er软件从这些序列中搜寻到729个SSR，分布于667条EST中，出现频率为12．08％，分布频率为1／3．99kb。单、二和三核苷酸重复是主导类型，三者共占总数的89．71％。A／T、AG／CT和AAG／CTT分别是单、二和三核苷酸的优势重复基元，分别占总数的29．77％、21．12％和14．95％。黄瓜EST-SSR以4～10次重复为主，基序长度主要集中于12～20bp。最后对这些EST-SSR的多态性潜能进行了评价。

甘薯与牵牛EST资源的SSR信息分析

为挖掘番薯（Ipomoea）属EST—SSR资源，从NCBI数据库下载23406条甘薯（印omoeabatatas（L．）Lam．）EST和62282条牵牛（巾omoeanil（L_）Roth）EST，利用生物信息学软件预处理、去冗余、拼接后得到12812条无冗余的甘薯EST（6．70Mb）和28422条牵牛唯一序列（17．19Mb）。对这些序列进行SSR搜索，在甘薯上获得328个SSR位点，出现频率为2．56％：牵牛上筛选到962个SSR位点，出现频率为3．38％。甘薯和牵牛EST．SSR具有多个共同特征：在SSR位点中，主要是二核苷酸重复类型，其次是三核苷酸重复；在二核苷酸重复中，出现最多的重复基序为AG／CT，其次是AT／AT；在三核苷酸重复中，主要基序是AAG／CCT；SSR位点的长度主要集中在20—22bp。结果表明，搜索出的EST—SSR重复基序类型丰富、多态性潜能高，具有较高的开发和利用价值。

黑麦草EST-SSR分子标记开发及生物信息学分析

为加速分子标记在黑麦草中的应用,利用黑麦草EST数据库(Gen Bank/db EST)开展了黑麦草EST-SSR信息分析、标记开发和EST功能分析研究。在25 752条黑麦草EST序列中,共发现346条SSR序列,占整个EST总数的1.344%。其中,三核苷酸基序最多(39.60%),次之为二核苷酸基序(31.79%)。三核苷酸基序以GGC/CCG出现频率最高,为8.38%,其次是CGC/GCG(7.51%)、GCC/CGG(4.05%)和ATG/TAC(2.02%),二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高(14.45%),其次是GA/CT(10.98%)。根据这些含有SSR的EST序列,利用Primer Premier 5.0软件,对346条EST-SSR序列进行引物设计,共设计引物193对,其中分值在90分以上的有113对(32.66%)。利用Gen Bank的Blast N和Blast X程序对相应113条EST进行功能分析,72条EST序列与51种具有生物学功能的蛋白质同源。

芜菁见光肉质根表皮EST资源的SSR信息分析

对芜菁见光肉质根表皮3 798条无冗余EST的SSR信息进行了分析,共检出111个由13种重复基元所构成的SSR,检出率为2.92%,平均相距11.974kb出现1个SSR。其中,二核苷酸和三核苷酸重复基元的EST-SSR占主导地位,分别占被检SSR总数的54.05%和45.05%;AG/CT和AAG/CTT基元的重复分别是二核苷酸和三核苷酸类型重复中的优势重复,分别占二核苷酸和三核苷酸重复类型的88.33%和32.00%;这些EST-SSR中属于具有中等程度多态性的Type II类型占93.69%,仅少数(<7%)属于具有较高多态性的Type I类型。经过Blast2Go分析,与这些EST-SSR相关联的EST参与10个不同代谢途径。