蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因克隆与表达分析

为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用,以蓖麻叶片为材料,设计特异性引物,克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明,蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1590 bp;编码528个氨基酸;蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白;亲水性数值为负值,属于亲水性蛋白;RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个;RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中,与麻枫树的同源性最高,为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca^(2+)结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术,分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达,结果表明,RcCDPK29基因主要在茎中表达,盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长,RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降,分别在2,8,24 h达到最低,与0 h差异显著;叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长,用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此,RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示,RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCML42与巴西橡胶树一致性最高,达86.84%。qRT-PCR结果显示,RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达,在经NaCl处理后,RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达,在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器,通过与钙调素结合蛋白结合进而对植物细胞进行调控。当植物受到环境中NaCl侵害时,CML可以参加体内钙离子的调节,进而减轻盐胁迫对植物体的损害。综上,推测RcCML42在盐胁迫条件下的蓖麻信号转导中起重要作用。

蓖麻蒴果脱壳的力学分析

对蓖麻蒴果果壳的物理机械特性进行测定和分析,并将其简化成各向同性、均匀厚度的薄球壳,利用薄壳理论进行内力和位移分析,结果表明两对法向集中力作用比较有利壳的均匀破裂。

蓖麻SnRK2基因家族的鉴定和特征分析

SnRK2是一类植物特有的Ser/Thr类蛋白激酶。为研究其在蓖麻抗逆过程中的作用,基于蓖麻的基因组序列信息,利用生物信息学方法鉴定了6个蓖麻SnRK2蛋白激酶成员。分析发现这些蛋白具有亲水性属性,基因结构分析表明,植物SnRK2基因在进化过程中具有很高的保守性;系统与进化分析发现植物SnRK2蛋白在单、双子叶植物中分化显著,可能是独立演化的结果。高通量RNA-seq测序结果显示,大部分SnRK2基因在检测的各个组织中均有表达,且在不同组织间或种子发育的不同阶段没有明显的组织特异性;外源ABA处理种子后,Group 2的基因表达显著上调。进一步利用半定量RT-PCR技术检测外源(100μmol/L)ABA、(250mmol/L)Na Cl和(4℃)冷胁迫处理的幼苗,发现Group 2中的基因29908.m006067被这3种胁迫强烈激活,基因29772.m000313对ABA和冷胁迫有较强的响应。

与蓖麻果刺性状连锁的RAPD标记

为探讨蓖麻果刺性状相关分子机理,以9个果实有刺和5个果实无刺的蓖麻为研究对象,对蓖麻果刺性状进行RAPD分析,结果表明:用单因素法优化后的蓖麻果刺相关性状的RAPD-PCR反应体系为Taq polymerase0.9μL、10×Buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、Mg2+1.3μL、SBS126号Primer 1.4μL、DNA 1.4μL、ddH2O 15.0μL,Total25μL;优化后的反应条件为94℃4 min 30 s;94℃45 s,38℃45 s,72℃45 s,35个循环;72℃5 min;4℃保存。利用优化后的反应体系与反应条件,在果实有刺材料中得到了约1 800 bp的片段,测序结果表明,9个材料的条带上游同源性非常差,但是距离下游约28 bp之前有长度为112 bp的序列完全相同,推断蓖麻果实有刺性状的发育可能与包含组氨酸的磷酸转移蛋白2有关。

蓖麻籽蛋白质的粗分离

以蓖麻籽中总蛋白为研究对象,对磷酸盐法提取蓖麻籽中粗蛋白过程进行优化。结果表明,在硫酸氨饱和度为70%时对蓖麻籽中粗蛋白的提取效率最高;利用优化后的磷酸盐法对7个不同发育时期的蓖麻籽中的蛋白质进行粗提取,并利用紫外分析法对所提取的不同生长阶段的蓖麻籽中的粗蛋白进行比较分析,结果发现自植株授粉后到获取蓖麻籽的时间间隔越长蓖麻籽中总蛋白积累量就越高。

蓖麻饼制取分离蛋白的研究

本文探讨用脱脂蓖麻饼制取分离蛋白的方法。实验表明,以弱硷性溶液提取蛋白的方法可以制取分离蓖麻蛋白。在所得成品中未检出蓖麻毒素,其蛋白质含量为80.20％,脂肪为1.89％,碳水化合物为4.87％。

脱脂蓖麻蛋白的营养与食品卫生学研究

本文用化学分析和动物实验的方法研究了内蒙产脱脂蓖麻蛋白的去毒及去毒后的营养与食品卫生质量。结果表明,脱脂去毒蓖麻蛋白的营养质量较好,食品安全性较为可靠,可以作为食物蛋白质的资源开发和利用。

植物生长物质和水解乳蛋白对蓖麻再生体系建立的影响

为筛选蓖麻再生体系建立的最佳配方,本研究以云杂N-2蓖麻种子为供试材料,对蓖麻种子消毒后,取胚轴分别接种在MS(Murashige and Skoog)为基本培养基上,并附加不同浓度的IAA(0.1 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L)、6-BA(0.5 mg/L、0.7 mg/L和0.9 mg/L)及不同浓度水解乳蛋白(0 mg/L、250 mg/L、500 mg/L和750 mg/L),进行愈伤组织培养和分化培养.结果表明:在IAA浓度为0.3 mg/L、6-BA浓度为0.7 mg/L时蓖麻愈伤组织诱导率最高为80%;在IAA和6-BA浓度最适,水解乳蛋白的浓度为500 mg/L时,愈伤组织生长状况最佳,呈淡黄色,褐化程度低;诱导芽增殖的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA,芽的增殖系数达6.15.

蓖麻分离蛋白的安全性评价

为开发利用蓖麻分离蛋白,本文按食品毒理学方法,对其进行了初步的安全性毒理学评价,包括急性毒性试验、蓄积毒性试验和Ames试验。结果表明,蓖麻分离蛋白的经口LD_(50)为21500mg/kg,为无毒物质。在40天的蓄积毒性试验中,538mg/kg、1075mg/kg、2150mg/kg及4300mg/kg四个试验组和一个对照组的动物均无异常表现,各试验组的体重增重和对照组相似,说明蓖麻分离蛋白粉对小鼠无蓄积毒性作用,对小鼠体重增重也无不良影响。蓖麻分离蛋白的微核阳性率为2.4‰,和阴性对照组的微核阳性率相同,而阳性对照组的微核阳性率为28‰。Ames试验显示菌麻分离蛋白粉对测试菌无诱变活性。故认为蓖麻分离蛋白粉没有经口致死毒性和致突变性。

环保型多肽-改性蓖麻油两亲性加脂剂的制备及应用

皮革下脚料经过MgO溶液热水解,提纯萃取后得到蛋白类多肽液;蓖麻油经过酯交换后与马来酸酐酯化,得到蓖麻油马来酸酐单酯。蛋白类多肽液与蓖麻油马来酸酐单酯反应制得两亲性加脂剂。两亲性加脂剂对革加酯后进行理化指标检测,结果证明加酯后的革不仅表面油润感强,各项指标符合国标(QB/T 1872—2004)值。加酯后的出鼓废液调节pH=3.0后加入到铬鞣剂中鞣制皮革,发现主鞣后的熟皮厚度比单独铬鞣剂鞣制增厚约8%,实验结果令人满意。

蓖麻生长素外输载体PIN蛋白家族的生物信息学分析

PIN蛋白家族是植物重要的生长素外输载体,通过介导细胞间的生长素极性运输来调控生长素在植物组织间的差异分布,从而调控植物的生长发育。目的:分离鉴定出蓖麻中PIN蛋白家族成员,为蓖麻生长素极性运输机制的研究奠定基础。方法:利用生物信息学分析软件,以拟南芥PIN基因家族序列为模板,在蓖麻基因组数据库中进行PIN基因鉴定,并对鉴定到的候选基因进行序列分析、所编码蛋白的结构域分析、信号肽预测、磷酸化位点分析以及系统进化分析。结果:蓖麻中共鉴定到7条编码PIN蛋白的同源序列,平均长度为537个氨基酸残基,平均分子量为58.64 ku,均属于脂溶性较好的碱性蛋白,结构稳定,具有9至10个跨膜结构域。系统进化分析结果表明,蓖麻PIN基因与同属于大戟科的木薯、橡胶树和麻风树的PIN基因进化关系较为密切。利用蓖麻基因表达数据库对鉴定到的RcPIN基因的表达模式进行了分析,并利用RT-PCR进行了验证,结果表明,RcPIN1-1和RcPIN1-2在根、叶、雌花和胚中表达水平较高,RcPIN2主要在根中表达,RcPIN3、5、6和8在所有检测的组织均有表达。

蓖麻蛋白粉酿制酱油探讨

本文利用蓖麻蛋白粉代替部分豆粕试制酱油，每ｋｇ 主料产二级酱油５－３ｋｇ，原料蛋白质利用率８０－１３５％ 。经过试产及数据分析，证明蓖麻蛋白粉是完全可以取代部分豆粕原料。

蓖麻饼提取蛋白质的研究

本文就蓖麻籽榨油后所剩的物质———蓖麻饼中提取分离蛋白质进行了研究 ,采用正交设计方法 ,进行提取分离蛋白质的工艺实验 ,得到了蛋白质提取率在67.5% -93.1 %的较佳工艺条件。

矮秆蓖麻天冬氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及蛋白纯化

目的克隆表达矮秆蓖麻(Ricinus communis L)天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease,AP)基因(RcAP)并进行蛋白纯化。方法Q-PCR法验证高秆及矮秆蓖麻六叶期叶片RcAP基因表达量;提取矮秆蓖麻六叶期叶片总RNA,PCR扩增RcAP基因,克隆至pETM30载体中,构建重组表达质粒pETM30-RcAP[含谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)标签],转化至E.coli DH5α感受态细胞中,优化IPTG诱导浓度及温度,SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性;采用亲和层析纯化重组蛋白GST-RcAP。结果矮秆蓖麻RcAP基因表达量为高秆蓖麻RcAP基因的3.7倍;经PCR及双酶切鉴定,重组表达质粒pETM30-RcAP构建正确;最适诱导条件为0.1 mmol/L IPTG 16℃诱导;重组蛋白GST-RcAP以可溶形式表达,相对分子质量约为62000;纯化的重组蛋白GST-RcAP浓度为6 mg/mL。结论成功构建了重组表达质粒pETM30-RcAP,获得了可溶性重组蛋白GST-RcAP,本研究为解析RcAP蛋白晶体结构、探索矮化基因与表型的联系奠定了理论基础并提供了试验依据。

蓖麻矮化相关RcDof蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蓖麻矮化相关RcDof蛋白。方法利用SignalP 4.0 server和Iprscan软件分别预测RcDof基因的信号肽和结构域。从pMD-18T-RcDof质粒中PCR扩增RcDof(44-101)基因,克隆入原核表达载体pETMBP-XE,构建原核表达质粒pETMBP-XE-RcDof(44-101),IPTG诱导表达重组蛋白,利用亲和层析、阳离子交换层析以及分子筛层析对目的蛋白进行纯化。结果RcDof基因无信号肽剪切序列,在44~101个碱基之间存在1个锌指保守结构域。重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约43000,以可溶形式存在于上清中。纯化的重组蛋白纯度较高,浓度为10 mg/mL。结论获得了高纯度可溶RcDof蛋白,为解析其晶体结构及探索其在蓖麻中作用的分子机制提供了实验依据。

蓖麻基因组毒素家族的生物信息学分析

采用生物信息学方法对蓖麻毒素蛋白家族的28条蛋白序列进行分析与预测,分别将这28条蛋白序列与NCBI中蓖麻毒素的序列以及凝集素的序列进行BLAST比对,确定60629.m00002是NCBI中蓖麻毒素,60637.m00004是凝集素。通过对蓖麻毒素进行基因结构分析,发现蓖麻毒素家族中除一条序列含有7个外显子,其余分别含有1~3个外显子,基本理化性质的预测结果表明蓖麻毒素家族的氨基酸数目、分子质量、疏水性等都存在一定的差异。二级结构预测显示蓖麻毒素蛋白主要由β螺旋和无规则卷曲组成,毒素蛋白家族主要分布在细胞质和周质中。利用同源建模法构建28条蓖麻毒素蛋白序列的三维结构模型,构建蓖麻毒素基因的系统进化发育树。